本发明属于药物
技术领域：
，具体涉及一种复方丹参片中丹酚酸b和冰片含量的测定方法和应用。
背景技术：
：近红外光谱(nearinfrared，简称nir)分析技术是20世纪80年代后期迅速发展起来的一项测试技术，系通过测定被测物质的近红外光谱区(波长范围约在2526～780nm，按波数计约为12000～4000cm-1)的特征光谱，并利用适宜的化学计量学方法提取相关信息后，主要用于有机物质定性和定量分析的一种检测技术。近红外光照射到物质后，会发生吸收、透射、散射、全反射、漫反射等几种相互作用形式。依据上述作用形式，近红外光谱的采集方式主要有三种：透射式、漫反射式、透漫射式，其中以透射、漫反射式较为常用。相对应的测量技术有透射法、漫反射法和反射透射法。透射法适用于透明液体样品的分析；漫反射法主要用于分析固体和半固体样品。用近红外光照射被测样品，利用有机物中含有oh、nh等化学键泛频振动或转动，以漫发射方式获得在近红外去的吸收光谱，通过多元线性进行回归等计量学手段，建立物质光谱与待测成分含量间的线形或非线形模型，从而实现用物质近红外光谱信息对待测成分含量的快速计算。复方丹参片是《中国药典》收录记载的中成药，由丹参、三七、冰片3味药制成；具有活血化瘀、理气止痛的功能。用于气滞血瘀所致的胸痹，症见胸闷、心前区刺痛；冠心病心绞痛见上述证候者。多年来对复方丹参片的丹酚酸b测定都是按照中国药典2015版一部的复方丹参片含量测定的丹酚酸b测得。中国药典2015版收载的丹酚酸b测定方法为高效液相色谱法。而中国药典2015版中并未收载复方丹参片中冰片成分的测定方法，查阅相关文献可知常用测定方法为气相色谱法。但这些方法都存在耗能、耗时，操作较复杂等因素，无法快速反映复方丹参片的丹酚酸b和冰片的含量值，不利于复方丹参片生产过程中的在线快速质量分析，提高生产效率，不适合中药现代化生产发展的需要。现有的丹酚酸b和冰片的含量测定方法是离线检测，需要检验人员到生产车间对待分析样品进行抽样和相应的预处理，无法及时的反馈问题，存在分析结果滞后的缺陷，而且费力、费物、耗能、耗时。因此，当前迫切需要研究一种快速、高效、准确的新的分析检测方法。技术实现要素：因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种复方丹参片中丹酚酸b和冰片含量的测定方法和应用。在阐述本发明的技术方案之前，定义本文中所使用的术语如下：术语“msc”是指：多元散射校正；术语“rmsecv”是指：内部交叉验证均方差；术语“rmsep”是指：外部验证均方差；术语“bias”是指：偏差；术语“nir光谱”是指：近红外光谱。为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种复方丹参片中丹酚酸b和冰片含量的测定方法，该测定方法包括以下步骤：(1)校正集样本收集：采集复方丹参片校正样品集，用高效液相色谱测定校正集样品的丹酚酸b含量值，用气相色谱测定校正集样品的冰片含量值，用近红外光谱仪对校正集中样品进行数据采集，得到复方丹参片的原始nir光谱数据；优选地，所述近红外光谱仪扫描方式为积分球漫反射扫描；(2)建立校正模型：将步骤(1)采集的所述复方丹参片的原始nir光谱数据，采用一阶导数+多元散射校正等方法，将高效液相色谱法测定的丹酚酸b含量值、气相色谱法测定的冰片含量值与采集的复方丹参片的nir光谱相对应建立校正模型；(3)选取验证样品集：利用近红外光谱仪扫描，测出验证集中复方丹参片的nir光谱，输入校正模型中，得出验证样品集中丹酚酸b和冰片的含量值，对校正模型进行修正；(4)检测待测样品：将待测样品研细，扫描其nir光谱图，将nir特征光谱图输入到校正模型，经过校正模型的测定得到该样品中丹酚酸b和冰片的含量。根据本发明第一方面的测定方法，步骤(1)中所述测定校正集样品的丹酚酸b含量值过程包括以下步骤：(a)对照品溶液的制备：取丹酚酸b对照品适量，精密称定，加水制成溶液；(b)供试品溶液的制备：取复方丹参片，糖衣片去除糖衣，研细精密称定，加水超声处理，离心取上清液即得；(c)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定含量。优选地，步骤(a)中所述丹酚酸b对照品溶液的浓度为10～200μl/ml，优选为50～100μl/ml，最优选为60μl/ml；步骤(b)中所述供试品溶液浓度为1～20mg/ml，优选为1～10mg/ml，最优选为3mg/ml。更优选地，步骤(c)中所述液相色谱仪采取watersc185μm4.6×250mm色谱柱；以乙腈-甲醇-甲酸-水(10:30:1:59)为流动相；检测波长为286nm。根据本发明第一方面的测定方法，步骤(1)中所述测定校正集样品的冰片含量值过程包括以下步骤：(ⅰ)对照品溶液的制备：分别取异龙脑、龙脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成溶液；(ⅱ)供试品溶液的制备：取复方丹参片，糖衣片去除糖衣，研细精密称定，加入无水乙醇超声处理，滤过取续滤液为供试品溶液；(ⅲ)分别取龙脑对照品溶液、异龙脑对照品溶液、供试品溶液注入气相色谱仪，测定含量。优选地，步骤(ⅰ)中所述异龙脑对照品溶液的浓度为0.01～1mg/ml，优选为0.1～1mg/ml，最优选为0.2mg/ml；所述龙脑对照品溶液的浓度为0.01～1mg/ml，优选为0.1～1mg/ml，最优选为0.3mg/ml；步骤(ⅱ)中所述供试品溶液浓度为1～20mg/ml，优选为1～10mg/ml，最优选为2mg/ml。根据本发明第一方面的测定方法，步骤(1)中所述采集复方丹参片的原始nir光谱数据分辨率为4～16cm-1，优选为8～16cm-1，最优选为8cm-1；扫描次数为1～128次，优选为16～64次，最优选为64次；扫描范围12500～4000cm-1；测试温度为10～35℃，优选为18～25℃。根据本发明第一方面的测定方法，所述步骤(3)中丹酚酸b校正模型的验证，光谱预处理方法为一阶导数和多元散射校正，光谱范围选择10846.2～10013cm-1、9195.3～8362.2cm-1和6719.1～4242.8cm-1，主因子数为10。优选地，所述步骤(3)中对冰片校正模型的验证，光谱预处理方法为一阶导数和矢量归一化，光谱范围选择10846.2～5060.5cm-1；主因子数为10。本发明的第二方面提供了一种复方丹参片的制备方法，所述方法包括：在复方丹参片成品离线包装前，采用本发明第一方面所述的测定方法对所述复方丹参片进行在线检测分析。为了提高生产效率，适应中药现代化生产发展，此发明提供一种快速，制样简单，可实现产品的无损质量检测的在线分析方法。本发明之目的就是提供一种近红外光谱快速测定复方丹参片中丹酚酸b和冰片含量的方法，可有效解决复方丹参片中丹酚酸b和冰片含量的快速同时测定，提高生产效率的问题，其解决的技术方案是，首先建立校正模型，收集复方丹参片样本作为校正样本集，并扫描得到校正样本集的近红外光谱图(12500～4000cm-1)，对得到的光谱数据进行光谱的预处理，并采用常规分析--按照中国药典2015版一部的复方丹参片含量测定的丹酚酸b测定中的高校液相色谱法测得的结果和气相色谱法测定冰片含量的结果为参考值，应用化学计量学建立复方丹参片光谱与其丹酚酸b和冰片含量值之间的校正模型，对于待测的复方丹参片样品，只需将样品研细，扫描其近红外光谱图，把经过相应光谱预处理的光谱数据输入到校正模型，经过校正模型的测定即得到该复方丹参片的丹酚酸b和冰片含量，光谱数据输入由计算机及其软件实现，整个过程时间短、速度快、准确，可在线测定，提高生产效率，节省大量的人力和物力，可创造巨大的经济和社会效益。本发明是由以下步骤实现的：1、校正集样本收集采集复方丹参片校正样品集，对校正集中的每一个样品，利用近红外光谱仪进行数据采集，得到复方丹参片的原始nir光谱数据；2、建立校正模型将步骤1采集的复方丹参片样品集的原始光谱数据，采用一阶导数+多元散射校正等方法，将高效液相色谱法测定的丹酚酸b含量值、气相色谱法测定的冰片含量值与采集的复方丹参片的近红外特征光谱相对应建立校正模型。利用brukeropus6.5/quant-2定量分析软件中的预处理方法并应用其提供的自动优化模型功能(optimize)，比较内部交叉验证均方差(rmsecv)和相关系数的大小，自动进行光谱范围及预处理方法的选择，根据内部交叉验证均方差(rmsecv)最小的原则，分别建立了丹酚酸b和冰片的4个较好的校正模型备用。3、选取验证样品集利用近红外光谱仪扫描，测出验证集中复方丹参片的nir光谱，输入校正模型中，从而得出验证样品集中丹酚酸b和冰片的含量值，快速而准确；若与验证样品集的高效液相色谱法测定的丹酚酸b测定值和气相色谱法测定的冰片测定值对照，判定验证集样品是否为界外点，正确认定后，加入外界点重新按校正模型建立步骤重新建立校正模型，备用，对校正模型要不断完善；4、用检验过的校正模型来预测待测复方丹参片样品中丹酚酸b和冰片的含量对于待测的复方丹参片样品，只需将样品研细，扫描其近红外光谱图，而后通过计算机提取的nir特征光谱图输入到校正模型，经过校正模型的测定即得到该复方丹参片中丹酚酸b和冰片的含量。本发明的分析方法可以具有但不限于以下有益效果：1.本发明用一种检测方法可以快速测定复方丹参片丹酚酸b和冰片的含量；2.本发明的近红外光谱法快速，制样简单，可进行在线分析；3.本发明的近红外光谱法经定标建模后，无须使用其他化学分析手段，并可实现产品的无损质量检测，无污染；4.本发明的分析方法克服现有高效液相色谱法测定的丹酚酸b和气相色谱法测定的冰片存在耗能、耗时、操作较复杂等因素，快速反映复方丹参片的丹酚酸b和冰片含量值；5.本发明的方法更加有利于复方丹参片丹酚酸b和冰片快速测定，分析过程时间短、速度快、准确，可在线测定，提高生产效率，节省大量的人力和物力，可创造巨大的经济和社会效益。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1示出了复方丹参片丹酚酸b校正集rmsecv与主因子数的相关。图2示出了复方丹参片校正集中丹酚酸b含量预测值与真实值的相关。图3示出了复方丹参片校正集中丹酚酸b含量偏差与真实值的相关。图4示出了丹酚酸b校正集复方丹参片nir光谱图。具体每条光谱代表的厂家和批号见表1。图5示出了复方丹参片冰片校正集rmsecv与主因子数的相关。图6示出了复方丹参片校正集中冰片含量预测值与真实值的相关。图7示出了复方丹参片校正集中冰片含量偏差与真实值的相关。图8示出了冰片校正集复方丹参片nir光谱图。具体每条光谱代表的厂家和批号见表2。具体实施方式下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。以下实施例中使用的试剂和仪器如下：试剂：复方丹参片，购自云南白药集团股份有限公司、广州白云山和记黄埔中药有限公司、广西新龙制药有限责任公司、华佗国药股份有限公司、郑州瑞龙制药股份有限公司等；乙腈，甲醇，甲酸，丹酚酸b对照品，异龙脑对照品，龙脑对照品购自中国食品药品检定研究院；watersc185μm4.6×250mm色谱柱，购自沃特世科技(上海)有限公司；db-ffap毛细管柱，购自北京八方世纪科技有限公司。仪器：傅立叶变换近红外光谱仪，购自德国bruker公司、型号mpa型。实施例1本实施例用于说明校正集样本的采集。(1)收集不同批号的复方丹参片样本，实际中还可根据校正模型的适用范围，其数量可不断的增加，研细，备用。以下表1为图4中从上至下每条图谱所代表的厂家及批号，表2为图8中从上至下每条图谱所代表的厂家及批号。表1丹酚酸b模型图谱用到的厂家及批号表2冰片模型图谱用到的厂家及批号(2)校正集样品的丹酚酸b和冰片含量值测定：a：丹酚酸b含量值测定色谱条件与系统适用性试验：watersc185μm4.6×250mm色谱柱；以乙腈-甲醇-甲酸-水(10:30:1:59)为流动相；检测波长为286nm。理论板数按丹酚酸b峰计算应不低于4000。对照品溶液的制备：取丹酚酸b对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含60μl的溶液，即得。供试品溶液的制备：取复方丹参片10片，糖衣片去除糖衣，研细，取0.15g，精密称定，置50ml量瓶中，加水适量，超声处理(功率300w，频率50khz)30分钟，放冷，加水至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注人液相色谱仪,测定，即得。根据对照品溶液测出的值，计算供试品溶液中的丹酚酸b含量值。b：冰片含量值测定色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为db-ffap毛细管柱(柱长30m，内径0.32mm，膜厚度0.25μm)；柱温为110℃；进样口温度为200℃；检测器温度为200℃；分流比为1:1。对照品溶液的制备：分别取异龙脑、龙脑对照品适量，精密称定，加无水乙醇制成每1ml各含0.2mg、0.3mg的混合对照品溶液。供试品溶液的制备：取复方丹参片，糖衣片去除糖衣，研细，取约0.2g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入无水乙醇10ml，称定重量，超声处理15min(频率37khz，功率350w)，放冷，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。分别取龙脑对照品溶液、异龙脑对照品溶液、供试品溶液2μl注入气相色谱仪，理论板数按龙脑峰计算不低于3000。龙脑和异龙脑的分离度大于1.5。根据对照品溶液测出的值，计算供试品溶液中的龙脑和异龙脑的含量值，即冰片的含量值。(3)对校正样品集进行数据采集及校正模型的建立，利用近红外光谱的仪器(德国bruker公司的mpa型傅立叶变换近红外光谱仪，光源：卤钨灯，检测器：pbs，附漫反射积分球，样品旋转器和石英样品杯)测样方式：积分球漫反射，分辨率：8cm-1，扫描次数：64次，扫描范围12500～4000cm-1，室温：18-25℃。利用近红外光谱仪进行数据采集复方丹参片的原始nir光谱，每个样品重复扫描3次，取平均光谱。采用opus6.5分析软件，对光谱预处理和谱区选择，得到复方丹参片中丹酚酸b和冰片含量的特征光谱信息。利用一阶导数+多元散射校正等方法法，将高效液相色谱法测定的丹酚酸b含量值、气相色谱法测定的冰片含量值与特征光谱数据相对应建立样品校正模型。在nir漫反射光谱的采集过程中，有时会由于仪器状态、样品状态与测量条件的差异造成nir光谱发生细微的变化，通过对光谱信号进行预处理以消除这些影响，改善模型的性能。在近红外光谱全区域中，不同波长处的光谱吸收信息对于最后建立模型的贡献价值是不同的，在模型波长处，杂质吸收和干扰大大强于目标组分产生的吸收，因此删除这些波长的光谱吸收有助于提高模型的准确度。由表3和表4可知，表内的4个预处理方法和谱段范围的维数和rmsecv值都较为接近，故分别建立4个校正模型，通过外部验证结果选择最优模型。建立校正模型：应用化学计量学建立复方丹参片特征光谱信息与其丹酚酸b的含量值之间的4个校正模型。表3不同预处理方法和谱区范围对丹酚酸b含量值模型的影响表4不同预处理方法和谱区范围对冰片含量值模型的影响实施例2本实施例用于说明检验样本集的丹酚酸b含量和最优模型的选择。(一)检验样品集的选取：根据校正样品集有代表性样品的选择，除建立校正样品集之外的5份样品。通过检验样品集检验校正模型是否可靠，检验模型的实用性能并确定最优模型。将检验样品集中的样品研细后，按上述条件进行近红外光谱扫描。获取检验样品集光谱时采用的测量方法和条件同获取校正样本集光谱时所采用的测量方法和条件保持一致。把检验样品集中样本的光谱进行光谱预处理和谱区选择，这些都要与校正样本集中方法保持一致，就是要一一对应。把光谱特征输入校正模型可以分别计算出检验集中丹酚酸b的含量值。得到的nir预测值与高效液相色谱法测定的丹酚酸b实测值的相关系数外部验证均方差(rmsep)和偏差(bias)。表5是4个校正模型对检验样本集的预测结果相关系数，由表5可知，校正模型的外部验证均方差(rmsep)和偏差(bias)越小，预测结果越接近检验样本集的丹酚酸b真实值，表中外部验证均方差(rmsep)和偏差(bias)的差异不大，结合rmsecv值和r2综合考虑，确定校正模型ⅰ是最优模型，表6和表7是校正模型ⅰ对检验样本集的预测结果，由表7可知，用校正模型ⅳ对检验样本集中的5个样品的丹酚酸b进行预测，外部验证均方差(rmsep)为0.809％，其高效液相色谱法测定结果与nir光谱法的测定结果相对偏差在正负10％以内，预测结果较为准确。表54个校正模型对检验样本集的丹酚酸b预测结果相关系数方法组分光谱rmsepbiasseprpd20170620-x1.q2丹酚酸b50.8090.3830.7977.7320170620-x2.q2丹酚酸b50.7850.5940.57310.720170620-x3.q2丹酚酸b51.150.4021.215.1120170620-x4.q2丹酚酸b50.7880.3710.7777.93表6校正模型ⅰ对检验样本集的丹酚酸b预测结果表7校正模型ⅰ对检验样本集的丹酚酸b预测结果(二)校正模型的评价：校正集的光谱数据经预处理后，应用brukeropus6.5分析软件，采用一阶导数+多元散射校正等方法法将校正集样品的nir光谱与其丹酚酸b含量值进行关联，建立了定量校正模型。图1为校正集rmsecv与主因子数之间的相关图，由图1可知，当复方丹参片丹酚酸b的定量校正模型主因子数为10时，可使校正集rmsecv最小，确定最佳主成分数为10。一阶导数+多元散射校正方法定量校正模型对复方丹参片中丹酚酸b含量的相关系数为91.05，内部交叉验证均方差(rmsecv)为1.72，主因子数为10，复方丹参片nir光谱与其丹酚酸b含量之间存在较好的相关性。图2和图3分别为复方丹参片校正集样品交互验证后得到的nir预测值与丹酚酸真实值的相关图和nir偏差与丹酚酸b真实值的相关图，由图可知，复方丹参片nir光谱与其丹酚酸b含量之间存在较好的相关性。(三)校正模型精密度考察：取同一样品，用近红外光谱仪重复扫描6次，将所得nir光谱输入复方丹参片的丹酚酸b含量校正模型中重复计算6次，考察模型的精密度，rsd值为0.60％(n＝6)。结果见表8，由表8可知仪器和校正模型精密度良好。表8精密度试验(四)校正模型重现性考察：取同一批样品6份，分别进行近红外光谱仪扫描，将所得的nir光谱输入复方丹参片的丹酚酸b含量校正模型中计算丹酚酸b含量，rsd值为1.08％(n＝6)。结果见表9，由表9可知校正模型的重现性良好。表9重现性试验(五)校正模型的修正与维护。当样品的测定时间或空间条件改变时，必须用检验样品集检验校正模型，如果校正模型的预测效果降低，就需要在校正样品集增加这一检验样品，并重新按上述步骤修改校正样品集。实施例3本实施例用于说明检验样本集的冰片含量和最优模型的选择。(一)检验样品集的选取：根据校正样品集有代表性样品的选择，除建立校正样品集之外的5份样品。通过检验样品集检验校正模型是否可靠，检验模型的实用性能并确定最优模型。将检验样品集中的样品研细后，按上述条件进行近红外光谱扫描。获取检验样品集光谱时采用的测量方法和条件同获取校正样本集光谱时所采用的测量方法和条件保持一致。把检验样品集中样本的光谱进行光谱预处理和谱区选择，这些都要与校正样本集中方法保持一致，就是要一一对应。把光谱特征输入校正模型可以分别计算出检验集中冰片的含量值。得到的nir预测值与气相色谱法测定的冰片实测值的相关系数外部验证均方差(rmsep)和偏差(bias)。表10是4个校正模型对检验样本集的预测结果相关系数，由表10可知，校正模型的外部验证均方差(rmsep)和偏差(bias)越小，预测结果越接近检验样本集的丹酚酸b真实值，表中外部验证均方差(rmsep)和偏差(bias)的差异不大，结合rmsecv值和r2综合考虑，确定校正模型ⅰ是最优模型，表11和表12是校正模型ⅰ对检验样本集的预测结果，由表12可知，用校正模型ⅰ对检验样本集中的5个样品的冰片进行预测，外部验证均方差(rmsep)为0.831％，其气相色谱法测定结果与nir光谱法的测定结果相对偏差在正负10％以内，预测结果较为准确。表104个校正模型对检验样本集的冰片预测结果相关系数表11校正模型ⅰ对检验样本集的冰片预测结果表12校正模型ⅰ对检验样本集的冰片预测结果(二)校正模型的评价：校正集的光谱数据经预处理后，应用brukeropus6.5分析软件，采用一阶导数+矢量归一化(snv)法将校正集样品的nir光谱与其冰片含量值进行关联，建立了定量校正模型。图5为校正集rmsecv与主因子数之间的相关图，由图可知，当复方丹参片冰片定量校正模型主因子数为10时，可使校正集rmsecv最小，确定最佳主成分数为10。一阶导数+矢量归一化(snv)定量校正模型对复方丹参片中冰片含量的相关系数为96.11，内部交叉验证均方差(rmsecv)为1.2，主因子数为10，复方丹参片nir光谱与其冰片含量之间存在较好的相关性。图6和图7分别为复方丹参片校正集样品交互验证后得到的nir预测值与冰片真实值的相关图和nir偏差与丹酚酸b和冰片真实值的相关图，由图可知，复方丹参片nir光谱与其丹酚酸b和冰片含量之间存在较好的相关性。(三)校正模型精密度考察：取同一样品，用近红外光谱仪重复扫描6次，将所得nir光谱输入复方丹参片的冰片含量校正模型中重复计算6次，考察模型的精密度，rsd值为0.86％(n＝6)。结果见表13，由表13可知仪器和校正模型精密度良好。表13精密度试验(四)校正模型重现性考察：取同一批样品6份，分别进行近红外光谱仪扫描，将所得的nir光谱输入复方丹参片的冰片含量校正模型中计算冰片含量，rsd值为1.81％(n＝6)。结果见表14，由表14可知校正模型的重现性良好。表14重现性试验(五)校正模型的修正与维护。当样品的测定时间或空间条件改变时，必须用检验样品集检验校正模型，如果校正模型的预测效果降低，就需要在校正样品集增加这一检验样品，并重新按上述步骤修改校正样品集，稳定的校正模型需要不断的完善。尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。当前第1页12