一种基于多克隆抗体的免疫比浊法测定载脂蛋白用的R2试剂及试剂盒的制作方法

本发明涉及载脂蛋白测定技术领域，具体地说涉及一种基于多克隆抗体的免疫比浊法测定载脂蛋白用的r2试剂及试剂盒。

背景技术：

载脂蛋白是血浆中脂蛋白的组成成分，主要分a、b、c、d、e五类，基本功能是运载脂类物质及稳定脂蛋白的结构，某些载脂蛋白还有激活脂蛋白代谢酶、识别受体等功能。载脂蛋白对脂蛋白的结构、功能和代谢至关重要，为诊断脂质代谢疾病提供有价值的指标。

目前测定载脂蛋白的方法主要有荧光免疫测定法、酶免疫分析法、酶联免疫法以及免疫比浊法，少量使用单克隆抗体elisa夹心法。其中，荧光免疫测定法较酶免疫分析法检测线性范围宽，精密度好，但需专门的检测仪器，检测成本较高；酶联免疫法灵敏度高，但是操作繁琐，用时较长，难以用于大规模自动化检测；elisa法检测灵敏度较高，但是仪器价格较高，也不适用于全自动检测。

而免疫比浊法因其灵敏度高，检测线性范围宽，且操作简便，易操作，自动化程度高，可用于全自动生化分析仪的优点，成为临床测定首选方法，与其他方法检测试剂比较，通用性较强。免疫比浊法应用原理是标本中的载脂蛋白特异地与羊抗人抗体反应，形成不溶性的复合物，引起浊度增加，可根据该不溶性复合物的浊度测定出样本中载脂蛋白的浓度。

免疫比浊法可以使用单克隆抗体或多克隆抗体，使用单克隆抗体，虽然杂蛋白较少，试剂能长期保存，但价格昂贵，因此，目前市场上载脂蛋白测定试剂盒(免疫比浊法)大都采用多克隆抗体，多克隆抗体虽然价格便宜，但是由于现在上游原料载脂蛋白多克隆抗体纯化技术不够成熟，导致获取不到较为纯净的多克隆抗体，杂蛋白较多，免疫试剂在杂蛋白过多的情况下，会加速试剂的变质，不利试剂长期保存。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于多克隆抗体的免疫比浊法测定载脂蛋白用的r2试剂及试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种基于多克隆抗体的免疫比浊法测定载脂蛋白用的r2试剂，按以下方法制备而成：将tris加入到水中，调节ph至7.4～7.5，然后加入nacl、edta-na2、聚乙二醇6000、载脂蛋白多克隆抗体、pc300，加水定容，得到初配液，然后对初配液进行密封静置处理，再对经过密封静置处理的初配液进行去除固体杂质处理，得到所述基于多克隆抗体的免疫比浊法测定载脂蛋白用的r2试剂。

进一步地，初配液中，各原料的含量为：tris20～100mmol/l、nacl6.5～9.0g/l、edta-na20.1～0.4g/l、聚乙二醇600020～40g/l、载脂蛋白多克隆抗体80～200ml/l、pc3000.9～1ml/l。

进一步地，密封静置处理的环境温度为2～8℃，时间为10～15d。在实施本发明的过程中，发明人发现，本发明的r2试剂在2～8℃密封状态下最适长期保存，因刚配制成的初配液含有大量的杂蛋白，静置10～15d可使体积较大的杂蛋白能更好地在聚乙二醇6000促聚下形成沉淀，有利于下一步过滤，不易堵塞过滤膜。

进一步地，去除固体杂质处理的具体步骤为：对经过密封静置处理的初配液进行初次抽滤，得到初滤液，对初滤液进行离心处理，取上清液，最后对上清液进行二次抽滤。在实施本发明的过程中，发明人发现，使用这种方法能够过滤掉体积较小的杂蛋白，且在过滤的过程中不易堵塞过滤膜，在工艺上更具有可操作性。

进一步地，所述r2试剂用于测定载脂蛋白a2，所述载脂蛋白多克隆抗体为载脂蛋白a2多克隆抗体，初配液中，各原料的含量为：tris50～100mmol/l、nacl6.5～8.0g/l、edta-na20.1～0.4g/l、聚乙二醇600020～30g/l、载脂蛋白多克隆抗体120～180ml/l、pc3000.9～1ml/l。在实施本发明的过程中，发明人发现，用于测定载脂蛋白a2时，各原料的含量具体选择在上述范围，试剂的保存时间更长，而且检测准确性也较好。

进一步地，所述r2试剂用于测定载脂蛋白c2，所述载脂蛋白多克隆抗体为载脂蛋白c2多克隆抗体，初配液中，各原料的含量为：tris20～50mmol/l、nacl6.5～8.0g/l、edta-na20.1～0.4g/l、聚乙二醇600020～40g/l、载脂蛋白多克隆抗体80～120ml/l、pc3000.9～1ml/l。在实施本发明的过程中，发明人发现，用于测定载脂蛋白c2时，各原料的含量具体选择在上述范围，试剂的保存时间更长，而且检测准确性也较好。

进一步地，所述r2试剂用于测定载脂蛋白c3，所述载脂蛋白多克隆抗体为载脂蛋白c3多克隆抗体，初配液中，各原料的含量为：tris20～50mmol/l、nacl6.5～9.0g/l、edta-na20.1～0.4g/l、聚乙二醇600020～35g/l、载脂蛋白多克隆抗体100～160ml/l、pc3000.9～1ml/l。在实施本发明的过程中，发明人发现，用于测定载脂蛋白c3时，各原料的含量具体选择在上述范围，试剂的保存时间更长，而且检测准确性也较好。

进一步地，所述r2试剂用于测定载脂蛋白e，所述载脂蛋白多克隆抗体为载脂蛋白e多克隆抗体，初配液中，各原料的含量为：tris50～100mmol/l、nacl6.5～9.0g/l、edta-na20.1～0.4g/l、聚乙二醇600020～40g/l、载脂蛋白多克隆抗体140～200ml/l、pc3000.9～1ml/l。在实施本发明的过程中，发明人发现，用于测定载脂蛋白e时，各原料的含量具体选择在上述范围，试剂的保存时间更长，而且检测准确性也较好。

一种免疫比浊法测定载脂蛋白的试剂盒，包括r1试剂和所述基于多克隆抗体的免疫比浊法测定载脂蛋白用的r2试剂。

进一步地，所述r1试剂包括以下原料：tris20～100mmol/l、nacl6.5～9.0g/l、edta-na20.2～0.8g/l、聚乙二醇600030～60g/l、吐温200.8～1.2ml/l、pc3000.9～1ml/l。

本发明的有益效果体现在：

本发明r2试剂有效去除了多克隆抗体杂蛋白，试剂的保存时间得到大大提升，并降低了试剂成本，而且去杂方法工艺简单，容易实施，具有非常好的应用前景。

本发明试剂盒采用免疫比浊法，制备方法简单，容易操作，自动化程度高，r2试剂杂蛋白含量少，试剂盒的保质期得到大大提升，临床应用非常广泛，与其他方法检测试剂比较，通用性较强。

附图说明

图1是实施例1的试剂盒2的r2试剂与现有r2试剂的吸光度对比图。

图2是实施例2的试剂盒2的r2试剂与现有r2试剂的吸光度对比图。

图3是实施例3的试剂盒2的r2试剂与现有r2试剂的吸光度对比图。

图4是实施例4的试剂盒2的r2试剂与现有r2试剂的吸光度对比图。

具体实施方式

下面将结合实施例来详细说明本发明。本部分对本发明实验中所使用到的材料以及实验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料、设备和操作方法是本领域公知的。实验所用几种材料说明如下：

edta-na2：乙二胺四乙酸钠；tris：三羟甲基氨基甲烷；pc300：一种复合液体生物防腐剂，主要成分是2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(mci)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(cmci)；载脂蛋白a2多克隆抗体来自深圳菲鹏生物股份有限公司；载脂蛋白c2多克隆抗体来自深圳菲鹏生物股份有限公司；载脂蛋白c3多克隆抗体来自深圳菲鹏生物股份有限公司；载脂蛋白e多克隆抗体来自北京达成生物科技有限公司。

实施例1

免疫比浊法测定载脂蛋白a2的试剂盒的制备

免疫比浊法测定载脂蛋白a2的试剂盒包括r1试剂和r2试剂；

所述r1试剂按以下方法制备而成：将tris加入到水中，使用37％的盐酸和naoh溶液调节ph至7.4，然后加入nacl、edta-na2、聚乙二醇6000、吐温20、pc300，加水定容，各原料的含量为tris50～100mmol/l、nacl6.5～8.5g/l、edta-na20.2～0.8g/l、聚乙二醇600030～50g/l、吐温200.8～1.2ml/l、pc3000.9～1ml/l；

所述r2试剂按以下方法制备而成：将tris加入到水中，使用37％的盐酸和naoh溶液调节ph至7.4，然后加入nacl、edta-na2、聚乙二醇6000、载脂蛋白a2多克隆抗体、pc300，加水定容，得到初配液，初配液中，各原料的含量为tris50～100mmol/l、nacl6.5～8.0g/l、edta-na20.1～0.4g/l、聚乙二醇600020～30g/l、载脂蛋白a2多克隆抗体120～180ml/l、pc3000.9～1ml/l，之后将初配液密封静置在2℃的环境中15天，再选用直径为0.45μm的醋酸纤维素膜对经过密封静置处理的初配液进行初次抽滤，得到初滤液，对初滤液用高速冷冻离心机进行离心处理，离心处理的转速为14000r/min，温度为2℃，时间为20分钟，取上清液，最后选用直径为0.22μm的醋酸纤维素膜对上清液进行二次抽滤，滤后溶液即为所述r2试剂。

下面提供免疫比浊法测定载脂蛋白a2试剂盒的几个具体实践配方，详见表1。

表1免疫比浊法测定载脂蛋白a2试剂盒的几个具体实践配方

免疫比浊法测定载脂蛋白a2试剂盒的r2试剂配制好后，每隔一段时间测定其空白吸光度和靶值32.6mg/dl质控血清的实测值，并与现有免疫比浊法测定载脂蛋白a2试剂盒的r2试剂(配方不同，未经静置、抽滤等操作)进行比较，结果见图1，下表2和表3。

表2免疫比浊法测定载脂蛋白a2试剂盒的r2试剂的空白吸光度

表3免疫比浊法测定载脂蛋白a2试剂盒的r2试剂的准确度

※产品性能要求：①试剂空白吸光度值：试剂空白吸光度值应≤0.500

②准确度：测定值与质控血清靶值相对偏差应≤15.0％。

从以上结果可以得出结论：载脂蛋白a2多克隆抗体中的杂蛋白被剔除，免疫比浊法测定载脂蛋白a2试剂盒的r2试剂的空白吸光度值明显优于现有r2试剂；随着时间的推移，免疫比浊法测定载脂蛋白a2试剂盒的r2试剂较现有r2试剂，具有更为稳定的试剂空白吸光度和准确度。

实施例2

免疫比浊法测定载脂蛋白c2的试剂盒，包括r1试剂和r2试剂；

所述r1试剂按以下方法制备而成：将tris加入到水中，使用37％的盐酸和naoh溶液调节ph至7.5，然后加入nacl、edta-na2、聚乙二醇6000、吐温20、pc300，加水定容，各原料的含量为tris20～50mmol/l、nacl6.5～9.0g/l、edta-na20.2～0.8g/l、聚乙二醇600035～60g/l、吐温200.8～1.2ml/l、pc3000.9～1ml/l；

所述r2试剂按以下方法制备而成：将tris加入到水中，使用37％的盐酸和naoh溶液调节ph至7.5，然后加入nacl、edta-na2、聚乙二醇6000、载脂蛋白c2多克隆抗体、pc300，加水定容，得到初配液，初配液中，各原料的含量为tris20～50mmol/l、nacl6.5～8.0g/l、edta-na20.1～0.4g/l、聚乙二醇600020～40g/l、载脂蛋白c2多克隆抗体80～120ml/l、pc3000.9～1ml/l，之后将初配液密封静置在4℃的环境中13天，再选用直径为0.45μm的醋酸纤维素膜对经过密封静置处理的初配液进行初次抽滤，得到初滤液，对初滤液进行离心处理，离心处理的转速为13000r/min，温度为4℃，时间为20分钟，取上清液，最后选用直径为0.22μm的醋酸纤维素膜对上清液进行二次抽滤，滤后溶液即为所述r2试剂。

下面提供免疫比浊法测定载脂蛋白c2试剂盒的几个具体实践配方，详见表4。

表4免疫比浊法测定载脂蛋白c2试剂盒的几个具体实践配方

免疫比浊法测定载脂蛋白c2试剂盒的r2试剂配制好后，每隔一段时间测定其空白吸光度和靶值2.82mg/dl质控血清的实测值，并与现有免疫比浊法测定载脂蛋白c2试剂盒的r2试剂(配方不同，未经静置、抽滤等操作)进行比较，结果见图2，下表5和表6。

表5免疫比浊法测定载脂蛋白c2试剂盒的r2试剂的空白吸光度

表6免疫比浊法测定载脂蛋白c2试剂盒的r2试剂的准确度

※产品性能要求：①试剂空白吸光度值：试剂空白吸光度值应≤0.500

②准确度：测定值与质控血清靶值相对偏差应≤15.0％。

从以上结果可以得出结论：载脂蛋白c2多克隆抗体中的杂蛋白被剔除，免疫比浊法测定载脂蛋白c2试剂盒的r2试剂空白吸光度值明显优于现有r2试剂；随着时间的推移，免疫比浊法测定载脂蛋白c2试剂盒的r2试剂较现有r2试剂，具有更为稳定的试剂空白吸光度和准确度。

实施例3

免疫比浊法测定载脂蛋白c3的试剂盒，包括r1试剂和r2试剂；

所述r1试剂按以下方法制备而成：将tris加入到水中，使用37％的盐酸和naoh溶液调节ph至7.45，然后加入nacl、edta-na2、聚乙二醇6000、吐温20、pc300，加水定容，各原料的含量为tris20～50mmol/l、nacl6.5～9.0g/l、edta-na20.2～0.8g/l、聚乙二醇600035～60g/l、吐温200.8～1.2ml/l、pc3000.9～1ml/l；

所述r2试剂按以下方法制备而成：将tris加入到水中，使用37％的盐酸和naoh溶液调节ph至7.45，然后加入nacl、edta-na2、聚乙二醇6000、载脂蛋白多c3克隆抗体、pc300，加水定容，得到初配液，初配液中，各原料的含量为tris20～50mmol/l、nacl6.5～9.0g/l、edta-na20.1～0.4g/l、聚乙二醇600020～35g/l、载脂蛋白c3多克隆抗体100～160ml/l、pc3000.9～1ml/l，之后将初配液密封静置在6℃的环境中12天，再选用直径为0.45μm的醋酸纤维素膜对经过密封静置处理的初配液进行初次抽滤，得到初滤液，对初滤液进行离心处理，离心处理的转速为12000r/min，温度为6℃，时间为20分钟，取上清液，最后选用直径为0.22μm的醋酸纤维素膜对上清液进行二次抽滤，滤后溶液即为所述r2试剂。

下面提供免疫比浊法测定载脂蛋白c3试剂盒的几个具体实践配方，详见表7。

表7免疫比浊法测定载脂蛋白c3试剂盒的几个具体实践配方

免疫比浊法测定载脂蛋白c3试剂盒的r2试剂配制好后，每隔一段时间测定其空白吸光度和靶值7.68mg/dl质控血清的实测值，并与现有免疫比浊法测定载脂蛋白c3试剂盒的r2试剂(配方不同，未经静置、抽滤等操作)进行比较，结果见图3，下表8和表9。

表8免疫比浊法测定载脂蛋白c3试剂盒的r2试剂的空白吸光度

表9免疫比浊法测定载脂蛋白c3试剂盒的r2试剂的准确度

※产品性能要求：①试剂空白吸光度值：试剂空白吸光度值应≤0.500

②准确度：测定值与质控血清靶值相对偏差应≤15.0％。

从以上结果可以得出结论：载脂蛋白c3多克隆抗体中的杂蛋白被剔除，免疫比浊法测定载脂蛋白c3试剂盒的r2试剂空白吸光度值明显优于现有r2试剂；随着时间的推移，免疫比浊法测定载脂蛋白c3试剂盒的r2试剂较现有r2试剂，具有更为稳定的试剂空白吸光度和准确度。

实施例4

免疫比浊法测定载脂蛋白e的试剂盒，包括r1试剂和r2试剂；

所述r1试剂按以下方法制备而成：将tris加入到水中，使用37％的盐酸和naoh溶液调节ph至7.5，然后加入nacl、edta-na2、聚乙二醇6000、吐温20、pc300，加水定容，各原料的含量为tris50～100mmol/l、nacl6.5～9.0g/l、edta-na20.2～0.8g/l、聚乙二醇600035～60g/l、吐温200.8～1.2ml/l、pc3000.9～1ml/l；

所述r2试剂按以下方法制备而成：将tris加入到水中，使用37％的盐酸和naoh溶液调节ph至7.5，然后加入nacl、edta-na2、聚乙二醇6000、载脂蛋白e多克隆抗体、pc300，加水定容，得到初配液，初配液中，各原料的含量为tris50～100mmol/l、nacl6.5～9.0g/l、edta-na20.1～0.4g/l、聚乙二醇600020～40g/l、载脂蛋白e多克隆抗体140～200ml/l、pc3000.9～1ml/l，之后将初配液密封静置在8℃的环境中10天，再选用直径为0.45μm的醋酸纤维素膜对经过密封静置处理的初配液进行初次抽滤，得到初滤液，对初滤液进行离心处理，离心处理的转速为10000r/min，温度为8℃，时间为20分钟，取上清液，最后选用直径为0.22μm的醋酸纤维素膜对上清液进行二次抽滤，滤后溶液即为所述r2试剂。

下面提供免疫比浊法测定载脂蛋白e试剂盒的几个具体实践配方，详见表10。

表10免疫比浊法测定载脂蛋白e试剂盒的几个具体实践配方

免疫比浊法测定载脂蛋白e试剂盒的r2试剂配制好后，每隔一段时间测定其空白吸光度和靶值37.5mg/l质控血清的实测值，并与现有免疫比浊法测定载脂蛋白e试剂盒的r2试剂(配方不同，未经静置、抽滤等操作)进行比较，结果见图4，下表11和表12。

表11免疫比浊法测定载脂蛋白e试剂盒的r2试剂的空白吸光度

表12免疫比浊法测定载脂蛋白e试剂盒的r2试剂的准确度

※产品性能要求：①试剂空白吸光度值：试剂空白吸光度值应≤0.500

②准确度：测定值与质控血清靶值相对偏差应≤15.0％。

从以上结果可以得出结论：载脂蛋白e多克隆抗体中的杂蛋白被剔除，免疫比浊法测定载脂蛋白e试剂盒的r2试剂空白吸光度值明显优于现有r2试剂；随着时间的推移，免疫比浊法测定载脂蛋白e试剂盒的r2试剂较现有r2试剂，具有更为稳定的试剂空白吸光度和准确度。

应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。