一种基于纳孔有机共价骨架材料的内源性肽富集方法与流程

本发明涉及材料分析化学和蛋白组学领域，尤其涉及基于纳孔有机共价骨架材料的内源性肽富集方法。

背景技术：

人体内的内源性肽，在信号传导^[1]、炎症反应^[2]、内分泌^[3]等生理过程中扮演了关键角色。一些内源性多肽还是重要的疾病标志物，例如淀粉样多肽之于阿兹海默症^[4]、利钠肽之于心脏病^[5]、胰岛素原之于糖尿病^[6]等。然而由于内源性多肽在人血等生物样品中含量极低以及生物样品本身成分的复杂性，对于人体内源性肽的富集和鉴定目前仍是一个巨大的挑战。传统的内源性肽富集方法包括乙腈沉淀^[7，8]、超滤^[9]、反相固相萃取^[10，11]等。乙腈沉淀和超滤对于内源性肽的回收率较低^[8，11]，近年来，由于富集材料的不断开发，利用疏水作用富集内源性肽的反相固相萃取法得到了发展^[12]。尤其是以mcm-41为代表的有序介孔硅材料，以其均一的孔结构、超大的比表面积，在对内源性肽的富集应用中收到了良好的效果^[13]。然而结构功能单元单一、表面电荷可调性差等缺点限制了无机多孔材料在这一领域的进一步发展。共价有机骨架聚合物(cofs)，是一种新兴的多孔晶体材料。除了兼具孔径均一、比表面积超大等无机多孔材料的优点，这种有机多孔晶体材料还具有灵活可变的结构功能单元和丰富、易于修饰的表面官能团。而迄今为止，未见此类材料应用于内源性肽富集的报道。本发明所采用的共价有机骨架聚合物tpb-dmtp-cof，其制备方法于2015年首次见诸报道^[14]。由于其具有强疏水性、均一孔径、超大比表面积以及电荷可调性，申请人认为该材料是一种能从复杂样品中高效高选择性富集内源性肽的极具潜力的新型材料。本发明采用spe及dspe等模式，通量高，方法灵活，操作简便，并且通过优化酸、缓冲盐及上样液、淋洗液、洗脱液的组成及比例，实现了对复杂样品中内源性肽的高选择性富集。

参考文献：

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14h.xu，j.gao，d.jiang，nat.chem.，2015，7，905-912.

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有高选择性、覆盖率广、普适性强、操作简单的从复杂样品中富集内源性肽的方法。本方法使用一种共价有机骨架聚合物材料tpb-dmtp-cof，以蛋白及其酶解物的混合物以及血清为富集对象，采用反相色谱分离模式，通过优化酸或缓冲盐的类型和浓度，上样液、淋洗液及洗脱液中有机相和水相的比例等参数，实现了对内源性肽的高效、高选择性富集。

本发明目的采用下述方案来实现：

本发明的内源性肽富集方法利用了共价有机骨架聚合物材料tpb-dmtp-cof的纳孔结构去除蛋白，同时利用材料的高疏水性和可调控的表面电荷捕获内源性肽，应用固相萃取(spe)或分散固相萃取(dspe)操作模式，具体步骤如下：

1.制备共价有机骨架聚合物材料tpb-dmtp-cof：由2，5-二甲氧基对苯二甲醛和1，3，5-三(4-氨苯基)苯，在乙酸催化下于120℃聚合得到。制备流程如下所示：

共价有机骨架聚合物tpb-dmtp-cof制备流程

2.用制备的共价有机骨架聚合物材料tpb-dmtp-cof，通过spe或dspe操作模式，富集蛋白及其酶解液的混合物或血清中的内源性肽，血清优选为人血清。所述共价有机骨架聚合物材料tpb-dmtp-cof的比表面积是826.5m²g^-1，该材料具有六方密堆规则排列的孔道结构，孔径均一，为2.5nm，其表面电荷性质可通过ph来调节，当ph＜5.9时材料表面带正电荷，当ph＞5.9时材料表面带负电荷。

将所述共价有机骨架聚合物tpb-dmtp-cof作为富集材料，蛋白及其酶解物、或者血清为样品材料，采用柱固相萃取模式(spe)或分散固相萃取模式(dspe)富集和纯化内源性肽；

在spe模式下，首先将tpb-dmtp-cof富集材料加载到末端带有筛板的移液枪枪头或者spe小柱上，采用洗脱液冲洗富集材料，之后用上样液平衡富集材料，然后将溶解在上样液中的样品材料加载到富集材料上，之后采用淋洗液冲洗富集材料，最后用洗脱液洗脱富集材料上的内源性肽；

在dspe模式下，将tpb-dmtp-cof富集材料置于离心管中，采用洗脱液冲洗富集材料，然后用上样液平衡富集材料，之后把富集材料与溶解在上样液中的样品材料混合，孵化后，离心弃上清液，所剩沉淀部分用淋洗液冲洗，震荡后，再次离心弃上清液，沉淀部分用洗脱液洗脱内源性肽，震荡后，离心取上清液浓缩即得内源性肽。

上样液组成为缓冲盐组成的缓冲液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为0-20％，缓冲盐的浓度为2-200mm，上样液ph在3-12范围内；

淋洗液组成为缓冲盐组成的缓冲液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为0-20％，缓冲盐的浓度为2-200mm，淋洗液ph在3-12范围内；

洗脱液组成为缓冲盐组成的缓冲液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为20-90％，缓冲盐的浓度为2-200mm，洗脱液ph在3-12范围内。

所用的蛋白酶解物应旋干去盐，与蛋白一起重溶于上样液，样品的上样量与tpb-dmtp-cof材料量之间的体积比例为1∶2-1∶1000，体积比优选为1∶2-1∶100，实验操作温度为15-50摄氏度。

采用spe模式富集内源性肽，冲洗富集材料所用洗脱液的体积为富集材料体积的2-50倍，平衡富集材料所用的上样液体积为富集材料体积的2-50倍，上样体积为富集材料体积的2-200倍，淋洗富集材料所用的淋洗液体积为富集材料体积的2-100倍，洗脱内源性肽所用的洗脱液体积为富集材料体积的2-30倍；采用dspe模式富集内源性肽，冲洗富集材料所用洗脱液的体积为富集材料体积的2-500倍，平衡富集材料所用的上样液体积为富集材料体积的2-500倍，上样体积为富集材料体积的2-1000倍，淋洗富集材料所用的淋洗液体积为富集材料体积的2-1000倍，洗脱内源性肽所用的洗脱液体积为富集材料体积的2-200倍。采用dspe模式富集内源性肽，振荡转数为100-2500rpm，样品材料与富集材料之间的孵化时间为10-120分钟，孵化温度为15-50摄氏度。

有机溶剂包括但不局限于乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、正己烷、环己烷、二硫化碳、四氯化碳、二氯甲烷、溴乙烷、苯、甲苯、乙酸乙酯、正丁醇、乙醚、异丙醇、四氢呋喃等中的一种或二种以上，缓冲盐包括但不局限于甲酸铵，甲酸钠，乙酸铵，乙酸钠，碳酸氢铵，碳酸钠，碳酸氢钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，柠檬酸钠，邻苯二甲酸氢钾，三羟甲基氨基甲烷等；所用的缓冲溶液包括但不局限于甲酸-甲酸铵，甲酸-甲酸钠，乙酸-乙酸铵，乙酸-乙酸钠，碳酸氢铵，碳酸钠-碳酸氢钠，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，磷酸氢二钾-磷酸二氢钾，柠檬酸-柠檬酸钠，邻苯二甲酸氢钾-氢氧化钠，三羟甲基氨基甲烷-盐酸等中的一种或两种以上。

spe模式：

将蛋白酶解液旋干并与蛋白按一定质量比(1∶10-1∶10000)重溶于20-200μl上样溶液中，加载到装填有tpb-dmtp-cof材料的spe小柱上，活化之后，用平衡溶液平衡材料，用30-200μl淋洗液淋洗材料1-10次；最后用30-200μl洗脱液洗脱吸附的内源性肽，收集洗脱液。

dspe模式：

1)将1-3mg材料装入ep管中，活化及平衡材料，将蛋白酶解液旋干并与适量蛋白按一定质量比(1∶10-1∶10000)重溶于20-200μl上样溶液中，并和材料混匀，孵化5-30min，离心，移去上清液；

2)用20-200μl淋洗液淋洗材料，混合震荡3min，离心，弃去上清液，重复此步骤1-10次；

3)用20-200μl洗脱液洗脱内源性肽，混合震荡10min，离心，收集上清液。

本发明具有如下优点：

1.富集方法对内源性肽的覆盖度和回收率高：本发明所述的方法采用的共价有机骨架聚合物材料tpb-dmtp-cof，因其具有较强的疏水性，不仅对疏水性内源性肽有很强的保留，对于相对亲水的内源性肽也能保留，这一特点使其相较于一般反相固相萃取方法，能得到更高的内源性肽覆盖度和回收率。

2.富集材料的吸附量大：本发明所述的方法采用的共价有机骨架聚合物材料tpb-dmtp-cof具有较大的比表面积(826.5m²g^-1)，与样品之间的作用位点较多，因此对内源性肽吸附量较大。

3.富集方法的选择性高：由于共价有机骨架聚合物材料tpb-dmtp-cof具有有序排列的孔道结构，并且孔径均一，为2.5nm，这使得蛋白等大分子干扰成分不能进入材料孔道，只有小分子内源性肽才能进入；另外，材料的高疏水性增强了材料与内源性肽段之间的相互作用，从而实现对复杂样品中内源性肽的高选择性富集。

4.富集材料的表面电荷性质可调：当ph＜5.9时tpb-dmtp-cof材料表面带正电荷，当ph＞5.9时tpb-dmtp-cof材料表面带负电荷，这一特点使得该富集方法更加灵活。

5.富集方法的普适性强：本发明所述的方法通过向上样液、淋洗液、洗脱液中添加合适的酸或缓冲盐，优化其浓度和ph值，可以实现对复杂样品中内源性肽的有效富集。

6.富集方法的通量高：本发明所述的方法可采用分散固相萃取模式，可以在同一时间操作多个实验，通量高。

7.本发明所述的方法操作灵活简便，重复性好。

附图说明

图1为采用共价有机骨架聚合物材料tpb-dmtp-cof在dspe模式下富集牛血清白蛋白及其酶解液(质量比20∶1)中内源性肽的质谱图。

图2为采用共价有机骨架聚合物材料tpb-dmtp-cof在dspe模式下富集牛血清白蛋白及其酶解液(质量比1000∶1)中内源性肽的质谱图。

图3共价有机骨架聚合物tpb-dmtp-cof的透射电镜照片(b)、通过氮气吸附数据计算得到的孔径分布(a)及电势分布图(a插图)。通过透射电镜测量得到的孔径与氮气吸附数据计算得到的孔径数据良好吻合，均为2.5nm。该tpb-dmtp-cof材料是按照文献^[14]制备方法合成，由2，5-二甲氧基对苯二甲醛和1，3，5-三(4-氨苯基)苯，在乙酸催化下于120℃聚合得到。

具体实施方式

为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。

实施例中所用原料及设备：

2，5-二甲氧基对苯二甲醛、1，3，5-三(4-氨苯基)苯、邻二氯苯、正丁醇、四氢呋喃、牛血清白蛋白、甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵、碳酸氢铵均购自sigma-aldrich公司。所用水为milli-q(billerica公司)系统净化得到的去离子水，其他试剂如乙腈等均使用市售色谱级。去盐所用geloader枪头购自eppendorf公司，去盐所用c18材料(5μm，)购自华谱新创科技有限公司(北京)。质谱分析结果由esi-q-tofms(waters公司)获得。健康人血清样品来自大连医科大学第二附属医院，血清样品获得知情同意并经过伦理委员会通过。

本发明以下实施例所使用的共价有机骨架聚合物材料tpb-dmtp-cof结构式为：

制备方法如文献^[14]所述：2，5-二甲氧基对苯二甲醛(0.120mmol，23.3mg)和1，3，5-三(4-氨苯基)苯(0.080mmol，28.1mg)溶于邻二氯苯/正丁醇(0.5/0.5ml)混合物，乙酸(6mol/l，0.1ml)作催化剂，置于耐热玻璃管(10ml)中，玻璃管经脱气后密封120℃加热三天，然后离心分离收集沉淀物，用四氢呋喃洗涤六次，再置于索氏抽提器，用四氢呋喃回流一天以去除杂质。收集到的粉末状产物在120℃下干燥过夜，即得tpb-dmtp-cof材料。制备流程如下所示：

实施例1

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在spe模式下富集内源性肽。将2mg富集材料装入spe小柱中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与20μg牛血清白蛋白溶于60μl5％乙醇/甲酸-甲酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)，上样后，用60μl5％乙醇/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)淋洗，最后用30μl50％乙醇/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例2

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在spe模式下富集内源性肽。将2mg富集材料装入spe小柱中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与20μg牛血清白蛋白溶于60μl5％乙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)，上样后，用60μl5％乙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)淋洗，最后用30μl50％乙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例3

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在spe模式下富集内源性肽。将2mg富集材料装入spe小柱中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与20μg牛血清白蛋白溶于60μl5％甲醇/碳酸氢铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)，上样后，用60μl5％甲醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)淋洗，最后用30μl50％甲醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例4

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将3mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与40μg牛血清白蛋白溶于100μl3％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)，上样后，用100μl3％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)淋洗，最后用30μl50％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例5

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将3mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与40μg牛血清白蛋白溶于100μl3％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)，上样后，用100μl3％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)淋洗，最后用30μl50％乙腈/水溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例6

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将3mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与40μg牛血清白蛋白溶于100μl3％异丙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)，上样后，用l00μl3％异丙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)淋洗，最后用30μl50％异丙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例7

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将3mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与40μg牛血清白蛋白溶于100μl3％异丙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)，上样后，用100μl3％异丙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)淋洗，最后用30μl50％异丙醇/水溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例8

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将3mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与40μg牛血清白蛋白溶于100μl3％甲醇/碳酸氢铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)，上样后，用100μl3％甲醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)淋洗，最后用30μl50％甲醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例9

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将3mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与40μg牛血清白蛋白溶于100μl3％乙醇/碳酸氢铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)，上样后，用100μl3％乙醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)淋洗，最后用30μl50％乙醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例10

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将3mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与40μg牛血清白蛋白溶于100μl碳酸氢铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)，上样后，用100μl碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)淋洗，最后用30μl50％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例11

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将3mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与40μg牛血清白蛋白溶于100μl碳酸氢铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)，上样后，用100μl碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)淋洗，最后用30μl50％乙腈/水溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。结果如图1所示。

实施例12

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将5mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与2000μg牛血清白蛋白溶于6ml5％乙醇/甲酸-甲酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)，上样后，用2ml5％乙醇/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)淋洗，最后用30μl50％乙醇/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例13

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将5mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与2000μg牛血清白蛋白溶于6ml5％乙腈/甲酸-甲酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)，上样后，用2ml甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)淋洗，最后用30μl50％乙腈/水溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例14

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将5mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与2000μg牛血清白蛋白溶于6ml3％甲醇/甲酸-甲酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)，上样后，用2ml3％甲醇/甲酸-甲酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝4.8)淋洗，最后用30μl50％甲醇/水溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例15

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将5mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与2000μg牛血清白蛋白溶于6ml5％异丙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)，上样后，用2ml5％异丙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)淋洗，最后用30μl50％异丙醇/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例16

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将5mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与2000μg牛血清白蛋白溶于6ml5％环己烷/乙酸-乙酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)，上样后，用2ml乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)淋洗，最后用30μl50％环己烷/水溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例17

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将5mg材富集料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与2000μg牛血清白蛋白溶于6ml3％环己烷/乙酸-乙酸铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)，上样后，用2ml3％环己烷/乙酸-乙酸铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝5.9)淋洗，最后用30μl50％环己烷/水溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例18

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将5mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与2000μg牛血清白蛋白溶于6ml5％乙醇/碳酸氢铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)，上样后，用2ml5％乙醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)淋洗，最后用30μl50％乙醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例19

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将5mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与2000μg牛血清白蛋白溶于6ml3％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)，上样后，用2ml3％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)淋洗，最后用30μl50％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例20

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将5mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与2000μg牛血清白蛋白溶于6ml3％甲醇/碳酸氢铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)，上样后，用2ml3％甲醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)淋洗，最后用30μl50％甲醇/水溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。

实施例21

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。将5mg富集材料装入离心管中，2μl旋干的牛血清白蛋白酶解物(1mg/ml)与2000μg牛血清白蛋白溶于6ml3％乙腈/碳酸氢铵缓冲溶液中(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)，上样后，用2ml碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)淋洗，最后用30μl50％乙腈/水溶液洗脱。洗脱液直接在质谱上进行分析。结果如图2所示。

实施例22

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。5μl人血清用80μl去离子水稀释，100℃下变性5min，再加入1.6μl1mol/l碳酸氢铵溶液和73.4μl去离子水，与5mg材料在离心管中共同孵化上样，上样后用500μl3％甲醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)淋洗，最后用30μl40％甲醇/碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)洗脱。

实施例23

以tpb-dmtp-cof作为富集材料，在dspe模式下富集内源性肽。5μl人血清用80μl去离子水稀释，100℃下变性5min，再加入1.6μl1mol/l碳酸氢铵溶液和73.4μl去离子水，与5mg材料在离心管中共同孵化上样，上样后用500μl碳酸氢铵缓冲溶液(缓冲盐浓度为5mmol/ml，ph＝8.4)淋洗，最后用30μl50％乙腈/水溶液洗脱。洗脱液经过液相色谱-二级质谱分析和搜库，一共鉴定到416条内源性肽段。详见表格1。

表1.应用tpb-dmtp-cof材料从人血清样品中富集到的内源性肽