一种指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法与流程_2

1.一种指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法，其特征在于：该方法包括指纹图谱测定、氧自由基吸收能力测定和样品鉴定三个步骤，在相同试验条件下，将供试样品指纹图谱与同时检测的蜂胶、杨树树胶样品指纹图谱进行比较，并选定供试样品指纹图谱中的几个特征峰，以方便比较和结果判定蜂胶为真、伪或掺伪；同时以抗氧化特定指数的限定，与指纹图谱联合鉴定蜂胶为真、伪或掺伪。

2.根据权利要求1所述的一种指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法，其特征是，包括如下步骤：

(一)指纹图谱测定

1)供试样品前处理：取样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称定，用20倍以上(V/W)95％乙醇室温下超声提取30min以上，5000rpm以上离心15分钟，用95％乙醇配制成0.4～3mg/ml待测样品乙醇溶液，过0.45um滤膜于样品瓶中，待HPLC分析；

2)指纹图谱测定：向高效液相色谱仪注入10μl样液，在下述色谱条件下，收集0至60min的指纹色谱，积分收集相应峰面积积分表；

步骤2相应色谱条件：色谱柱：Venusil MP C18 250mm×4.6mm×5μm；流动相：甲醇+0.4％磷酸(V/V)＝65+35；柱温：25℃～30℃；进样量：10μl；流动相流速：0.6～1.2ml/min；检测波长：360nm；

(二)氧自由基吸收能力测定

1)供试样品处理：取样品，冷冻过夜，次日碾碎，精密称定，用20倍以上(V/W)95％乙醇室温下超声提取20min以上、5000rpm以上离心15分钟，提取两次，取上清液合并，水溶性样品用蒸馏水，脂溶性样品用95％乙醇，稀释至10.4mg/ml～24mg/ml水溶液或乙醇溶液，再用pH＝7.4磷酸缓冲液稀释1600倍，配制成浓度为6.5μg/ml～15μg/ml的样品缓冲溶液，为待测样品；

2)氧自由基吸收能力测定

(1)测定条件：测定仪器设定温度：35-37℃；激发光波长：485nm；发射光波长：538nm；测定时间:60min；测定频率：1min/once；

(2)试剂配制：FL浓度：0.63-0.67nmol/ml；AAPH浓度：20-30mg/ml；Trolox浓度：0.01～0.07μmol/ml；并按该样品的抗氧化性能强弱选择步骤1样品浓度范围中配制浓度。

(3)氧自由基吸收能力测定：在试管中加入1.25ml磷酸缓冲液，0.2ml的FL溶液，0.2ml的样品溶液，混匀后再加入0.35ml的AAPH溶液，震荡混匀后立即取1.3ml于各测试管中，置荧光分析仪中，按测定条件测定其荧光强度随时间的变化；

采用梯形法分别计算：空白、Trolox及样品曲线下积分面积AUC

其计算公式为：

ORAC值计算式：

ORAC单位：umol Trolox/g样品；

AUC样品——样品+AAPH+FL荧光衰减曲线下面积；

AUCTrolox——Trolox+AAPH+FL莹光衰减曲线下面积；

AUC空白——AAPH+FL荧光衰减曲线下面积；

(4)计算获得氧自由基吸收能力的测定结果：考察其净积分面积AUC与浓度之间的线性范围；取线性范围内不同浓度测定5个样品，做批间稳定性分析，再取线性范围内相同浓度测定3个样品，做批内稳定性分析，并取平均值作为其ORAC值；

(三)样品鉴定

在相同试验条件下，将供试样品指纹图谱与同时检测的蜂胶、杨树树胶样品指纹图谱进行比较，同时选定供试样品指纹图谱中的几个特征峰，以方便比较和结果判定：

1)蜂胶定性鉴别

供试样品与蜂胶质控样品相比，均含有主要特征色谱峰，且峰强度相似：

(1)出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积比值，后峰比前峰＞3；

(2)在上述主峰后与后一个主峰之间最大峰相对峰面积<0.2％；

(3)在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积＜2％；

(4)抗氧化指数：蜂胶毛胶ORAC>4000μmol TE/g，蜂胶乙醇提取物ORAC>7500μmol TE/g；

符合上述(1)-(4)，可判定供试样品为“真”；

2)杨树树胶定性鉴别

供试样品与蜂胶质控样品相比，均含有主要特征色谱峰，且峰强度相似：

(1)出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积比值，后峰比前峰＜3；

(2)在上述主峰后与后一个主峰之间最大峰相对峰面积>0.5％；

(3)在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积应大于10％；

(4)抗氧化指数：该胶毛胶ORAC＜1500μmol TE/g，乙醇提取物ORAC＜2500μmol TE/g；

符合上述(1)-(4)，可判定供试样品为“伪”；

3)蜂胶中掺入杨树树胶定性鉴别

供试样品与蜂胶质控样品相比，均含有主要特征色谱峰：

(1)出峰时间在18～22min之间有一个主峰，与该主峰紧密相连的前一个峰的相对峰面积比值，后峰比前峰＞2.5；

(2)在上述主峰后与后一个主峰之间最大峰相对峰面积>0.2％；

(3)在35.0～43.5之间，最大峰相对峰面积＞2％；

(4)抗氧化指数：该胶乙醇提取物ORAC＜4000μmol TE/g；

符合上述(1)-(4)，可判定供试样品为“掺伪”；

4)蜂胶中掺入黄酮类化合物定性鉴别

供试样品的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比均含有，但是某个特征峰峰高异常，其相对峰面积超过相应位置真蜂胶样品相对积分面积2倍以上，可判定样品为“掺伪”；再与芦丁、槲皮素等标准对照物质色谱图比较，可以判断添加黄酮类化合物的种类；

5)非蜂胶物质的定性鉴别

供试样品的主要特征色谱峰与蜂胶质控样品相比，不具有大部分蜂胶的主要特征色谱峰，可判定供试样品为“伪”。

3.根据权利要求2所述的指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法，其特征是，步骤(一)中，蜂胶质控样品指纹图谱出峰时间及积分面积为：

4.根据权利要求3所述的指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法，其特征是，步骤(一)中，在重复性条件下对同一试样连续进行两次以上测定，要求保留时间的RSD<1.5％，峰面积的RSD<5％。

5.根据权利要求2或3或4所述的指纹图谱与抗氧化活性联合鉴别蜂胶真伪的方法，其特征是，该方法适用于中国华东地区的杨树胶植被所产的蜂胶。