华盖散颗粒指纹图谱的测定方法与流程
本发明属于中药制剂检测领域，涉及华盖散颗粒指纹图谱的测定方法。
背景技术：
中药成分复杂，药效部位常常不是单一成分，以某种单一成分作为质量控制指标已越来越不适应中药质量控制的要求。因此，中药指纹图谱技术应运而生。
中药指纹图谱技术源于指纹鉴定学，利用现代信息技术和质量分析手段较全面的反映了中药所含化学成分的种类和数量。对于中药材，指纹图谱可以用来鉴别真伪、评判优劣；对于中成药，指纹图谱可以鉴别产品真伪，评判制备工艺的合理性，有效地控制产品质量。现阶段中药的有效成分大多数尚不明确，中药指纹图谱的整体性和模糊性正好适应这一特点，较单一成分的质量控制方法更具有科学性和全面性。目前国际上已认可将中药指纹图谱作为中药质量的控制模式。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快等优点，已成为当今指纹图谱的主要分析手段。
华盖散出自宋·陈师文《太平惠民和剂局方》，由麻黄、炒紫苏子、炒苦杏仁、陈皮、蜜桑白皮、赤茯苓、炙甘草共7味药物组成。方中以麻黄为君，辛温解表、宣肺平喘以祛风寒。臣以紫苏子，辛香降气化痰，苦杏仁辛苦温，化痰止咳平喘，二药共降利肺气，祛痰止咳。佐药陈皮辛温，燥湿化痰、理气行滞；桑白皮腥味甘寒，泻肺利水平喘；茯苓健脾渗湿，杜绝生痰之源；三药联用共祛湿消痰。甘草为使，调和诸药。诸药配伍，解表与化痰并用，痰湿得消，表寒得散，诸证自愈。全方主治肺感寒邪、咳嗽上气、胸膈烦满、项背拘急、声重鼻塞、头昏目眩、痰气不利、呀呷有声，广泛用于临床感冒、咳嗽、哮病、喘证等肺系疾病。太极集团重庆涪陵制药厂有限公司研发了我国第一个华盖散颗粒制剂。已被列为国家重大新药创制科技重大专项。但是，目前国内还没有文献报道对华盖散颗粒指纹图谱的研究。董自亮等人在《中草药杂志》(2016，47(3):425-429)中报道了华盖散传统汤剂的指纹图谱检测方法，而经过大量实验研究，该方法并非适宜华盖散颗粒成品的质量控制，不能系统、全面的反映华盖散颗粒的内在质量。为保障患者用药安全有效，发明一种控制华盖散颗粒整体质量的检测方法迫在眉睫。基于此，本发明建立了一种适应于华盖散颗粒的新的指纹图谱检测方法。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种华盖散颗粒指纹图谱的建立方法，通过该方法得到华盖散颗粒的标准指纹图谱，为华盖散颗粒的质量控制和真伪鉴别提供一种新的方法，并且该方法建立的指纹图谱能够较为全面的反应中药的物质信息，增强了指纹峰的可视化比较。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、华盖散颗粒指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：
(1)制备华盖散颗粒样品制备：取华盖散颗粒，研细，加甲醇溶液，超声溶解，冷却，再加甲醇溶液补足失重，摇匀，过滤，收集滤液得华盖散颗粒样品；
(2)色谱检测：将步骤(1)制得华盖散颗粒样品，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，柱温为27℃，流速为0.8～1.2ml/min，检测波长为278nm，流动相为乙腈和甲酸质量分数为0.01％的甲酸水条件下洗脱。
本发明中，所述甲醇溶液为体积分数50％的甲醇溶液，所述超声为超声至少30分钟。
本发明中，所述甲醇溶液加入量按每克华盖散颗粒加50ml甲醇溶液。
本发明中，步骤(1)由以下步骤代替：取华盖散颗粒，研细，加入乙醇溶液振摇分散后，静置过夜，离心分别收集上清和残渣，沉淀用乙醇溶液洗涤至残渣至上清液无色，离心，合并上清液，挥干溶剂，残渣用甲醇溶液溶解。
优选的，所述甲醇溶液为体积分数为50％的甲醇溶液，所述乙醇溶液为体积分数75％的乙醇溶液。
优选的，所述甲醇溶液加入量按每克华盖散颗粒加50ml体积分数为50％的甲醇溶液。
更优选的，所述离心为5000r/min条件下离心5min。
本发明中，所述洗脱为梯度洗脱，具体条件为：
0～25min，乙腈：甲酸质量分数为0.01％的甲酸水的体积比由2％﹕98％到7％﹕93％；
25～38min，乙腈：甲酸质量分数为0.01％的甲酸水的体积比由7％﹕93％→10％﹕90％；
38～60min，乙腈：甲酸质量分数为0.01％的甲酸水的体积比由10％﹕90％→15％﹕85％；
60～120min，乙腈：甲酸质量分数为0.01％。
本发明公开了华盖散颗粒指纹图谱的测定方法，具有如下优点：
(a)本发明首次公开华盖散颗粒指纹图谱的建立，指纹图谱能够较单一指标成分控制更全面的反应中药的物质信息，增强了指纹谱峰的整体性比较；
(b)供试品制作简便，色谱条件容易实现；
(c)方法稳定性和重现性均较好；
(d)有效表征了华盖散颗粒的质量，有利于产品质量监控；具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好；可准确地鉴别产品的真伪优劣。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为采用不同扫描方式对华盖散颗粒进行hplc指纹图谱检测的结果；
图2为采用不同色谱柱对华盖散颗粒进行hplc指纹图谱检测的结果；
图3为采用不同柱温对华盖散颗粒进行hplc指纹图谱检测的结果；
图4为采用不同流动相对华盖散颗粒进行hplc指纹图谱检测的结果；
图5为采用本发明所述方法检测华盖散颗粒的标准指纹图谱；
图6为本发明所述华盖散颗粒与单味药供试品溶液的色谱图结果；
图7为十批华盖散颗粒样品的指纹图谱叠加图，其由中药色谱指纹图谱相似度评价系统a版生成。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
本发明实施例仪器与试药：
仪器：岛津20a高效液相色谱仪(日本岛津公司)；n-1001d-wa旋转蒸发仪(日本eyela公司)；kq2200e型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；sartorius-bs124s电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。美国absciex公司api3000型三重四级杆串联质谱仪(配有turboionspray离子化源以及analyst1.4数据处理系统)；美国安捷伦公司agilent1100四元梯度泵和自动进样器。
试药：水为哇哈哈纯净水；乙腈和甲醇均为色谱纯；其余试剂为分析纯。
实验例1、色谱条件优化
1.扫描方式的考察
对不同波长条件下华盖散颗粒指纹图谱进行了比较，选择：190～400nm全波长扫描(提取波长278nm)和278nm单波长扫描两种扫描方式进行比较，获得的色谱图结果见图1所示。
从谱峰的分离度上看，278nm单波长扫描图峰形较好，各峰分离度好，基线平稳，好于190～400nm全波长扫描后提取的波长278nm图，故选择278nm单波长为华盖散颗粒指纹图谱的扫描波长。
2.色谱柱的选择
在同一色谱条件下，选择：thermosyncronisc18(250×4.6mm，5μm)和
3.柱温的考察
考察色谱柱温在27℃、30℃、35℃和40℃下的谱峰行为，获得的色谱图结果见图3所示。由图3可见，随着柱温的升高色谱峰的保留时间提前，色谱峰的分离情况变差，华盖散在27℃条件下分离度最佳，因此选择的柱温为27℃。
4.流动相的考察
在同一色谱条件下，对乙腈-0.01％磷酸水、乙腈-0.1％磷酸水、乙腈-0.01％甲酸水、乙腈-水和甲醇-0.01％磷酸水(流动相a﹕流动相b的体积比由7％﹕93％→10％﹕90％；从38～60min，流动相a﹕流动相b的体积比由10％﹕90％→15％﹕85％；从60～120min，流动相a﹕流动相b的体积比由15％﹕85％→40％﹕60％)五种不同的流动相进行考察，获得的色谱图结果见图4所示。
由流动相考察的实验结果可见，加入酸可以优化峰形，但是随着酸浓度的增加，色谱峰的分离度并没有实质性的变化，且较高的酸浓度不利于华盖散中生物碱的分离；乙腈-0.01％磷酸水和乙腈-0.01％甲酸水色谱图没有明显的差异，为了方便质谱分析选择乙腈-0.01％甲酸水；甲醇-0.01％磷酸水色谱峰较宽，并且若想达到较好的分离，可能需要较长的分析时间；综上所述，选择乙腈-0.01％甲酸水为流动相。
5、华盖散颗粒样品制备的优化
(1)供试品溶液制备方法的选择
采用现有技术中的四种制备方法获得供试品溶液，具体如下：
a、取华盖散颗粒粉末0.25g，精密称定，置25ml量瓶中，加体积分数50％的甲醇溶液20ml，超声处理30min，取出，放冷，加体积分数50％的甲醇溶液至刻度，摇匀，滤过，滤液过0.45μm微孔滤膜，即得；
b、取华盖散颗粒样品适量，研细，称取0.50g，加体积分数50％的甲醇溶液25ml，超声30min，放冷，补足失重，摇匀，过滤，即得；
c、取华盖散颗粒样品适量，研细，称取0.50g，加75％乙醇30ml，振摇分散后，静置过夜，离心(5000r/min)5min，用体积分数75％的乙醇溶液洗涤残渣至上清液无色(实际为10ml两次洗离)，离心，合并上清液，水浴挥干溶剂，残渣用体积分数50％的甲醇溶液溶解并定容至25ml，摇匀，过滤，即得。
d、取华盖散颗粒样品适量，研细，称取0.50g，加体积分数75％的乙醇溶液30ml，振摇分散后，静置过夜，离心(5000r/min)5min，用体积分数75％的乙醇溶液洗涤残渣至上清液无色(实际为10ml两次洗离)，离心，合并上清液，减压浓缩至挥干溶剂，残渣用体积分数50％的甲醇溶液溶解并定容至25ml，摇匀，过滤，即得。
分别对上述a-d四种制备方法所得的华盖散颗粒色图谱按照上述优化后的条件进行检测。结果显示，其指纹图谱的整体相同，b、c、d各峰型基本一致。但采用方法a时，供试品峰面积较小，需要较大的进样量才能达到预期的峰面积；采用方法c、d时，制备过程繁琐，周期较长，另外方法d中，甲醇作为供试品溶剂，各色谱峰峰形较差。综合考虑，最终选择方法b作为华盖散颗粒供试品溶液的制备方法。
(2)超声处理时间的选择
试验比较了在供试品溶液制备中，超声处理的时间分别为15min、30min、45min的华盖散颗粒指纹图谱。结果发现，随着超声时间的延长，各色谱峰峰面积有所增加，但超声30min与45min无差异，较佳的超声处理时间为30min。
实验例2、华盖散指纹图谱方法验证
1、指纹图谱检测
按照上述实验中优化后的检测条件进行华盖散颗粒的指纹图谱检测，具体包括：
取华盖散颗粒样品适量，研细，称取0.50g，加50％甲醇25ml，超声30min，放冷，补足失重，摇匀，过滤，即得供试品溶液。
照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，以乙腈为流动相a，以0.01％甲酸水为流动相b；控制流速为0.8～1.2ml/min；柱温27℃；检测波长：278nm；按照如下程序进行梯度洗脱：从0～25min，流动相a﹕流动相b的体积比由2％﹕98％→7％﹕93％；从25～38min，流动相a﹕流动相b的体积比由7％﹕93％→10％﹕90％；从38～60min，流动相a﹕流动相b的体积比由10％﹕90％→15％﹕85％；从60～120min，流动相a﹕流动相b的体积比由15％﹕85％→40％﹕60％。
吸取供试品溶液与对照品溶液10μl-20μl，注入液相色谱仪，测定。
检测得到的华盖散颗粒的标准指纹图谱详见图5所示，所得的华盖散颗粒的标准指纹图谱包括15个共有峰，各峰号的相对保留时间分别为：(1)13.909、(2)15.798、(3)46.185、(4)48.529、(5)61.984、(6)64.327、(7)74.229、(8)75.590(甘草苷)、(9)80.881、(10)82.393、(11)84.434(橙皮苷)、(12)85.568(迷迭香酸)、(13)97.360、(14)99.703、(15)105.750。
2、精密度试验
取同一供试品溶液，按上述实验中优化后的检测条件连续进样6次，记录色谱指纹图谱，考察各共有峰与内标峰相对保留时间和相对峰面积，结果见表1和2所示。
表1.精密度试验-相对保留时间
表2精密度试验-相对峰面积
结果表明，相对保留时间rsd<0.2％，相对峰面积rsd<10.0％，精密度良好。
3、稳定性试验
取同一供试品溶液，按实验中优化后的检测条件，分别在0h、3h、6h、9h、12h和24h进行检测，记录色谱指纹图谱，考察各共有峰与内标峰相对保留时间和相对峰面积，结果见表3和4。
表3、稳定性试验-相对保留时间
表4、稳定性试验-相对峰面积
结果表明，相对保留时间rsd<0.2％，相对峰面积rsd<10.0％，稳定性良好。
4重复性试验
取同一批次华盖散颗粒6份，按照上述供试品制备方法6份供试品溶液，按照上述检测方法，连续进样6次，记录色谱指纹图谱，考察各共有峰与内标峰相对保留时间和相对峰面积。结果见表5和6所示。
表5、重复性试验-相对保留时间
表6、重复性试验-相对峰面积
结果显示，相对保留时间rsd<0.2％，相对峰面积rsd<12.0％，重复性良好。
实验例3、华盖散颗粒hplc指纹图谱色谱峰指认
通过考察不同对照品的保留时间及紫外光谱，鉴别了华盖散颗粒hplc指纹图谱中8号峰(75.59min)为甘草苷、11号峰(84.434min)为橙皮苷、12号峰(85.568min)为迷迭香酸。通过光谱图给出的光学信息发现，华盖散颗粒色谱中与相应已知参照物色谱峰的紫外光谱吻合，获得的色谱图结果见图6所示，华盖散指纹图谱特征峰的来源分析结果见表7。
表7、华盖散指纹图谱特征峰的来源分析结果
实验例4、华盖散颗粒hplc指纹图谱的相似度评价
取华盖散颗粒10批次产品(批号为：20160101、20160102、20160103、16050007、16050008、16060009、16060010、16070011、16080012)由太极集团重庆涪陵制药厂有限公司提供。
按照前述实验例2中提供的方法进行指纹图谱的检测，获得的色谱图结果见图7所示。采用中国药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版》对hplc图谱进行综合评价，相似度结果见表8。
表8、相似度结果
从表8的相似度结果中可以看出，10批华盖散样品与参照谱以及根据中位数法生成的对照谱之间的相似度均大于0.9，表明不同批次华盖散样品相似度较好。因此，将华盖散颗粒的指纹图谱纳入其内控质量标准中，将其相似性定为不得小于0.90。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
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