本发明涉及一种杨梅素的测定方法，属于分析化学技术领域。
背景技术：
杨梅素，又称杨梅黄酮、杨梅酮，属黄酮醇类化合物，普遍存在于豆科(leguminosae)、报春花科(primulaceae)、葡萄科(vitaceae)、菊科(compositae)等植物中。其主要来源于杨梅科杨梅属植物杨梅myricarubra(lour)sieb.etzucc.的树叶、皮、根等的提取物；杨梅是原产中国的亚热带果树之一，主要分布于宁波余姚和慈溪等地。杨梅树皮和树叶中的活性成分杨梅素有多种理化作用：(1)血小板活化因子(paf)的拮抗作用，具有抗血栓、抗心肌缺血、改善微循环等多方面的心血管药理作用，(2)降血糖作用；(3)抗氧化作用；(4)保肝护肝作用；(5)解痉乙醇中毒；除上述已经验证的药理作用外，还具有抗炎、抗肿瘤、抗突变、预防龋齿、抗氧化性、消除体内自由基等多种药理作用。杨梅素的结构通式为
目前检测杨梅素的方法主要有高效液相色谱法、紫外分光光度法等，中国专利201610079019.9中介绍一种用hplc测定藤茶中11中黄酮类各成分的方法，它利用高压液相色谱可检测二氢杨梅素、二氢槲皮素、香橙素、杨梅素等黄酮类物质，但是采用高压液相色谱法分析检测的速度慢、药品、溶剂消耗大，而由于杨梅素和二氢杨梅素在测定波长下的吸光度相互干扰，采用紫外分光光度法分析结果不准确。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种杨梅素的分析测定方法，通过藤茶样品中的杨梅素与zrocl2络合成具有荧光的产物，利用荧光光谱法计算杨梅素的含量，所述方法具有操作简便快捷、结果准确、稳定性好的特点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种杨梅素的分析测定方法，它包括如下步骤：
a、制备测试样品：准确称取藤茶粉末，用少量甲醇浸泡，取上清液，用甲醇定容到棕色容量瓶中，得浓度为1.00-2.00mg/ml的藤茶样品溶液；
b、制备标准样品：称取杨梅素标准品，用甲醇溶解配制成不同浓度的系列杨梅素标准品溶液；
c、绘制标准曲线：在若干容量瓶中分别加入ch3coona-ch3cooh缓冲液和zrocl2溶液，再分别加入步骤b制得的系列杨梅素标准品溶液，用去离子水定容，摇匀，放置1h后用荧光分光光度计扫描荧光光谱，测量λex/λem＝460/545nm的荧光强度if，以杨梅素标准品的浓度为横坐标，荧光强度值为纵坐标作杨梅素标准曲线，得出荧光强度和标准品浓度的线性回归方程，if＝-0.29+1999.78c；
d、测定样品：在容量瓶中加入步骤a制得的测试样品溶液，重复步骤c，扫描荧光光谱，测量待测样品在λex/λem＝460/545nm的荧光强度，利用线性回归方程计算样品溶液中杨梅素的浓度。
上述杨梅素的分析测定方法，所述步骤c和步骤d中定容后反应溶液的ph值为4.0-4.5。
上述杨梅素的分析测定方法，所述zrocl2溶液是质量百分比浓度为2％的二氯氧化锆甲醇溶液，反应溶液中zrocl2的浓度为7.2×10-3-9.1×10-3mol/l。
上述杨梅素的分析测定方法，所述步骤c和步骤d的反应溶液中甲醇含量小于20％。
上述杨梅素的分析测定方法，所述步骤a中将藤茶粉末浸泡于10ml甲醇中，50℃超声溶解30min，静置24h，离心取上清液于25ml棕色容量瓶中，甲醇定容，得藤茶样品溶液。
本发明利用二氯氧化锆和样品中杨梅素络合成具有荧光的产物，再用荧光光谱法生成标准曲线，求得线性回归方程，从而计算出杨梅素的含量。利用zrocl2敏化荧光法分析藤茶中杨梅素含量是一种全新的检测杨梅素的方法，为藤茶质量评价提供了快速、准确的参考数据，可应用于实际样品如藤茶、杨梅的枝叶中杨梅素的检测。上述方法操作简单，只需将藤茶提取液与zrocl2溶液在有缓冲溶液的条件下混合，扫描荧光光谱即可分析得出其中的杨梅素的含量。同时它的分析速度快、反应灵敏度高，其检出的限量仅为3.3ng/ml，只有高压液相法3.1μg/ml的检出浓度的千分之一。
荧光法具有选择性高的特点，由于二氢杨梅素与zrocl2溶液不发生反应，能够完全区分样品中的结构类似物二氢杨梅素，从而避免荧光分光光度法中二氢杨梅素对测定结果的干扰，测定结果准确、数据重现性好。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是本发明标准溶液杨梅素(a)的三维荧光图谱；
图2是本发明样品溶液藤茶(b)的三维荧光图谱；
图3是本发明杨梅素系列标准溶液的三维荧光图谱；
图4是本发明藤茶样品溶液的三维荧光图谱；
图5是本发明藤茶样品加标系列溶液的三维荧光图谱；
图6是本发明杨梅素的荧光法标准曲线图；
图7是本发明杨梅素的荧光法加标曲线图；
图8是本发明杨梅素的色谱法标准曲线图；
图9是本发明杨梅素的色谱法加标曲线图。
具体实施方式
本发明所述的一种杨梅素的测定方法，包括如下步骤：
a、制备测试样品：准确称取粉碎的藤茶粉末于25ml棕色容量瓶中，用少量甲醇浸泡，50℃超声溶解提取30min，静置24h离心，取上清液，用甲醇定容到25ml棕色容量瓶中，得浓度为1.00-2.00mg/ml的藤茶样品溶液。所述甲醇为无水甲醇。
b、制备标准样品：准确称取杨梅素标准品于棕色容量瓶中，用无水甲醇溶解并定容至刻度，得浓度为1.00-10.00μg/ml的杨梅素标准品储备液。将杨梅素标准品储备液按照梯度稀释成一系列杨梅素标准品溶液。系列标准品溶液的浓度梯度范围为0.05-0.5μg/ml。
c、绘制标准曲线：在若干10ml容量瓶中分别加入一定体积的浓度为2％的zrocl2溶液和ch3coona-ch3cooh缓冲液，再分别加入步骤b制得的系列杨梅素标准品溶液，用去离子水定容，摇匀，溶液的ph值调节至4.2左右。放置1h后使用荧光分光光度计扫描荧光光谱，测量λex/λem＝460/545nm的荧光强度if，以杨梅素标准品的浓度为横坐标，荧光强度值为纵坐标作杨梅素标准曲线图，根据标准曲线图得标准品浓度与荧光强度if的线性回归方程。
所述zrocl2溶液为质量百分比浓度为2％的二氯氧化锆甲醇溶液。
所述荧光光谱的扫描范围为λex:330-550nm，λem:480-630nm，扫描间隔设定为5nm，狭缝宽度为ex/em:5.0/5.0，扫描速度为12000nm/min。
d、测定样品溶液：取一定体积的步骤a制得的测试样品溶液加入到10ml容量瓶中，再加入2％的zrocl2溶液和ch3coona和ch3cooh缓冲液，用去离子水定容，摇匀，使溶液的ph值调节至4.2。放置1h后使用荧光分光光度计扫描荧光光谱，测量λex/λem＝460/545nm的荧光强度if。利用步骤c得到的线性回归方程计算测试样品溶液中杨梅素的浓度。
反应溶液的ph范围在4.0-4.5时，杨梅素与zr形成稳定的络合物，有利于荧光光谱测定。ph过低小于3.5时，zrocl2在酸性环境中以zr4+存在，与杨梅素不容易结合；ph过高大于5.0时，zrocl2发生水解，与杨梅素的结合能力降低，从而荧光降低。
所述zrocl2溶液是浓度为2％(w/w)二氯氧化锆甲醇溶液。zrocl2的加入量为在反应溶液中其浓度范围为4.5×10-3-1.0×10-3mol/l，zrocl2的浓度优选为7.2×10-3-9.1×10-3mol/l。在优选浓度的范围内zrocl2与杨梅素产生的荧光强度最强且基本保持不变。由于溶液中甲醇的含量直接影响杨梅素的荧光强度，因此需控制反应溶液中甲醇的含量低于20％。
杨梅素与zrocl2发生络合反应，形成荧光强而且稳定的化合物，有利于准确进行定量地荧光检测分析。其络合反应的化学反应式为
试验浓度的藤茶样品溶液扫描紫外可见吸收光谱，样品溶液在460nm处的吸光度为0.0311，小于0.05，因此荧光光谱数据用于分析时可以忽略内滤光效应的影响。
实施例1
一、荧光法的验证试验
杨梅素标准品溶液的制备：准确称取0.00123g杨梅素标准品于25ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解定容，得49.2μg/ml的杨梅素储备液，用时稀释成相应浓度7.872μg/ml的杨梅素标准品溶液；
藤茶样品溶液的制备：将藤茶样品放入烘箱中干燥，粉粹，准确称取藤茶粉末0.04030g，用10ml无水甲醇浸泡，50℃超声溶解提取30min，静置24h离心，取上清液于25ml棕色容量瓶中，甲醇定容25ml棕色容量瓶中，得1612μg/ml的藤茶样品溶液。
zrocl2溶液的制备：取1.6212gzrocl2在小烧杯中，无水甲醇溶解，转移至100ml容量瓶中，用无水甲醇定容，得到2％(w/w)二氯氧化锆甲醇溶液(摩尔浓度为0.091mol/l)。
naac-hac溶液的制备：分别称取醋酸钠4.1002g，冰醋酸15.8ml在小烧杯中用水溶解，再转移至25ml容量瓶中，用水定容；分别取醋酸钠溶液、醋酸溶液1.00ml于250ml容量瓶中，加水稀释定容，得ph＝4.2缓冲溶液。
仪器：f-7000荧光分光光度计(hitachi)。
取13个10ml容量瓶，分别加入1.00ml的naac-hac溶液和1.00ml的2％zrocl2甲醇溶液。2-6号容量瓶分别加入杨梅素标准品溶液，体积分别为0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml，配制成浓度梯度的系列标准品溶液。7-13号容量瓶分别加入0.3ml藤茶溶液，10-13号容量瓶分别加入杨梅素标准溶液，体积分别为0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml，其中1-6号为杨梅素系列标准品溶液，7-9号为相同浓度的平行藤茶提取液，10-13为系列加标溶液，配制中各容量瓶中溶液的加入量如表1所示。各容量瓶中甲醇含量均小于20％，去离子水定容，摇匀，控制溶液的ph在4.20左右，放置1小时后扫描三维荧光光谱。分别得到杨梅素系列标准溶液三维荧光图谱、藤茶样品溶液三维荧光图谱、藤茶样品加标系列溶液三维荧光图谱，如图2、图3、图4所示。
表1为13个试品溶液的配制浓度表单位μgml-1
取6号和7号容量瓶的三维荧光图谱进行分析，从图1可以看出，a图中杨梅素标准溶液(6号容量瓶)的杨梅素与zrocl2敏化后产生两个荧光峰，激发波长λex分别为280/460nm，发射波长λem均为545nm；图2(b图)中藤茶样品溶液用zrocl2敏化后同样在λex/λem＝460/545nm处出现一个荧光峰，激发波长λex为280nm处没有出现荧光峰是因为280nm处吸光度太大，产生了内滤光效应，从而掩蔽了λex/λem＝280/545nm处的荧光峰。由于二者在长激发波长λex为460nm荧光峰的位置完全重合，形状基本吻合，所以藤茶提取液在加入zrocl2甲醇溶液之后产生的敏化荧光就是杨梅素与zr络合的敏化荧光，所以可以用荧光法采用杨梅素作为标准来测定藤茶中杨梅素的含量。
二、利用标准曲线法测定藤茶中杨梅素的含量
将图2中得到的三维图谱进行处理，读取杨梅素标准系列溶液的三维荧光图谱中λex/λem＝460/545nm处的荧光强度，数据如表2所示。以杨梅素标准品的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作杨梅素的标准曲线图(图5)。根据标准曲线图得标准品浓度与荧光强度的线性回归方程为if＝-0.29+1999.78c，浓度范围0.0787μg/ml-0.3936μg/ml，相关系数r＝0.9998，相关系数接近1说明上述回归方程的线性关系良好。荧光法检测的杨梅素浓度范围为0.07784-0.8757μg/ml。检测限d＝3sb/s＝3*2.2/1999＝0.0033μg/ml＝3.3ng/ml。
表2杨梅素标准系列溶液的荧光强度
如图3所示，读取藤茶样品三维荧光图谱中λex/λem＝460/545nm处的荧光强度，数据如表3所示。把藤茶样品的荧光强度的平均值带入回归方程，得到样品中杨梅素的平均浓度为c＝0.1108μg/ml，计算得藤茶中杨梅素的平均含量为0.2292％，结果的标准偏差为0.2903％。
表3藤茶中杨梅素含量测定
三、利用标准加入法测定藤茶中杨梅素的含量
将图4中得到的三维图谱进行处理，读取藤茶样品加标系列溶液的三维荧光图谱中460nm/545nm处的荧光强度(表4)，以加入标准品的浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，得到杨梅素加标曲线图(图6)，根据加标曲线求得加入标准品浓度与荧光强度的线性回归方程。加标曲线的线性回归方程为if＝225.3+2004.06504c，相关系数r＝0.9997。采用外推法可知，当if＝0时，横坐标的值即为样品中杨梅素的浓度，由回归方程得出c＝0.1124μg/ml，计算藤茶中杨梅素的含量为0.2325％。由标准曲线法测得的结果为0.2292％，两种方法测得的定量结果基本一致，符合数据分析的要求。
表4藤茶的加标回收率
由表4结果表明，加标法的回收率为101.3％，在范围95.0％-105.0％之内，标准偏差为2.17％，表明该方法具有较好的可靠性和准确性。
实施例2
一、高效液相色谱法检验藤茶中杨梅素的含量
杨梅素标准溶液：准确称取0.00640g杨梅素标准品于25ml棕色容量瓶中，甲醇定容，得256μg/ml的杨梅素储备液，使用时稀释。
藤茶样品溶液：准确称取实施例1中的藤茶粉末1.28752g于25ml棕色容量瓶中，用甲醇浸泡，50℃超声30min，甲醇定容，静置24h，得到51.50mg/ml的藤茶样品溶液，取上清液离心，使用时稀释。
仪器：色谱柱：agilentzorbaxsb-c18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相:甲醇-水(0.045％磷酸)＝55:45；检测器：紫外检测器；检测波长：370nm；流速：0.7ml/min；柱温：25℃；进样量：5μl。
分别取不同体积的杨梅素标准溶液于10ml容量瓶中，用甲醇稀释成浓度范围为0.5120-3.072μg/ml标准溶液，依次进样，采用高压液相色谱法进行检测。以杨梅素标准溶液的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，得到色谱法标准曲线图(图7)，进行线性回归得到线性方程：a＝-3.79+40.15c(μg/ml)，r＝0.9998。从图中可以看出，在此浓度范围内，杨梅素的峰面积与质量浓度呈现良好的线性关系。
在10ml容量瓶中分别加入浓度为206μg/ml的藤茶样品1.50ml，用甲醇定容，稀释成浓度为20.6μg/ml的藤茶提取液的样品溶液，在上述色谱条件下进行色谱分离，能达到基线分离。分析杨梅素标准品与藤茶样品溶液的色谱图可以看出，杨梅素标准品的保留时间为5.665min，相同条件下藤茶样品溶液的保留时间为5.660min，因此此处的色谱峰为藤茶中杨梅素的色谱峰。将藤茶样品平行进样三次，分别记录杨梅素的峰面积，取三次结果的平均值，根据得出的线性回归方程计算藤茶中杨梅素的含量，结果见表5。
表5色谱法测定藤茶样品中杨梅素的含量
由表5可知，高效液相法测定藤茶中杨梅素的含量为0.2256％，荧光法测定的藤茶中杨梅素的含量0.2292％，两种方法的检测结果比较接近。
二、高效液相色谱法的回收率
在4个10ml容量瓶中分别加入浓度为206μg/ml的藤茶样品1.50ml，再分别加入浓度为25.6μg/ml的杨梅素标准品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml，甲醇定容，依次自动进样5μl。以加入的杨梅素的质量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，得到加标线性关系图(图8)，加标曲线的线性方程为：a＝24.62+3.76m(μg)，r＝0.9999。
表6色谱法测定藤茶样品中杨梅素回收率
由表6的计算结果可知，藤茶样品中杨梅素的加标回收率良好。