烟用香精香料中邻苯二甲酸酯的测定方法与流程

本发明属于烟用添加剂有害成分理化分析领域，适用于烟用香精香料（液体，膏状和乳状）中邻苯二甲酸酯的测定。

背景技术：

烟用香精是食用香精的一种。在卷烟调制过程中加入香精，可以中和、纠正，或某种程度上改变烟草的吃味与口感，达到愉悦的效果。但是，烟用香精不仅用于烟丝加香，在卷烟包装材料（如卷烟纸，滤棒等）上也会使用，用于满足消费者的嗅觉需求。可以说，消费者在对卷烟产品进行消费时，有非常大的机会直接接触到烟用香精。关于烟用香精的安全卫生要求目前主要还是参考食用香精。

邻苯二甲酸酯（paes）是烟用香精香料安全卫生标准受控指标之一。但是此标准只规定了paes的特定迁移量，总量还是参考国标关于食用香精香料的限量（<60mg/kg）。烟用香精中的paes很大程度上来源于原料，因为某些paes可以降低香味物质的挥发；其次是香精在存储运输过程中从其它材料中转移获得的。paes目前公认是一种环境激素，其在体内的长期积累，会严重影响人体正常生理机能，具有致畸，致癌和致突变等危害。

关于香精中邻苯二甲酸酯的测定，并无相关推荐的国标方法。烟草行业内有关于烟用香精中测定推荐方法，但是此方法采用乙醇对样品直接稀释，采用gc-ms进行测定，没有除杂步骤，因此在使用中存在许多问题。一方面很多香精或香料不溶于乙醇（如一些浸膏），另外一个方面就是香精成分复杂，直接进样对分析柱和离子源都会有污染，且基质效应明显。本发明对现有方法的前处理和分析都进行了改进，适合目前大多数烟用香精香料中paes的测定。

技术实现要素：

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提出的一种烟用香精香料中邻苯二甲酸酯的测定方法，采用乙醇水溶液与待测香精香料样品进行混合，在对样品进行良好分散的同时，对样品中的待测成分进行初步提取；然后采用一定比例的正己烷/乙酸乙酯/异丙醇溶液对初提溶液进行液液萃取，采用气相色谱—质谱联用仪器（gc-ms）对其中的paes进行测定。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种烟用香精香料中邻苯二甲酸酯（paes）的测定方法，包括首先对待测样品进行前处理，再通过气相色谱-质谱联用（gc-ms）技术进行测定，具体过程如下：

（1）前处理

称取0.3-0.6g香精香料样品至25ml具塞三角瓶中，准确至0.0001g，加入7-15ml乙醇水溶液，再加入250µl内标溶液，超声萃取30min，取2ml初提溶液至15ml玻璃离心管中，加入5ml正己烷/乙酸乙酯/异丙醇溶液，在2000rpm的条件下涡旋振荡5min，后在4000转/分钟条件下离心5min，取上层清液，待测。

（2）空白实验

不加样品，重复（1）步骤。由于邻苯二甲酸酯在环境中普遍存在，因此，在所有测定paes的前处理中均需测定空白，如果空白中含有一定量的paes，不能简单扣除，需要严格查找原因，避免空白中paes的引入。

（3）仪器分析

采用gc-ms测定，测定条件如下。

气相色谱条件：

色谱柱固定相：5%苯基/95%甲基聚硅氧烷；规格：[30m（长度）×0.25mm（内径）×0.25μm（膜厚）]。

进样口温度：280℃；进样量：1μl，分流进样（分流比：10:1）；载气：氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0ml/min；升温程序：初始温度60℃，保持1min，以20℃/min的速率至220℃，保持1min，再以5℃/min的速率至280℃，保持15min。

质谱条件：

电离方式：电子轰击源（ei）；电离能量：70ev；传输线温度：280℃；离子源温度：280℃及以上；四极杆温度：150℃；测定方式：选择离子监视方式（sim）扫描；溶剂延迟：6min。各化合物sim条件见表1

（4）本发明中采用氘代-邻苯二甲酸二丁酯（dibutylphthalate-3,4,5,6-d4，cas号：93952-11-5）作为内标物，纯度≥99%，使用时采用乙醇稀释，浓度为0.1mg/ml。

（5）本发明中乙醇水溶液的浓度为50%，为体积百分比；正己烷/乙酸乙酯/异丙醇溶液的体积比例为3:1:1。

（6）实验应全部使用玻璃器皿，所用玻璃器皿洗净后，用一级水淋洗三次，丙酮浸泡1h，室温挥发干后，在200℃下烘烤2h，冷却至室温备用。

（7）标准溶液和内标溶液的配置：

混合标准溶液ⅰ：分别称取0.02g（精确至0.1mg）各种paes标准品，置于同一10ml容量瓶中，用正己烷/乙酸乙酯/异丙醇（3:1:1，v:v:v）溶解并定容，配制成浓度为2mg/ml的混合标准溶液ⅰ。于0℃～4℃冰箱中避光保存，有效期6个月。

混合标准溶液ⅱ：准确移取0.5ml混合标准溶液ⅰ，置于10ml容量瓶中，以正己烷/乙酸乙酯/异丙醇（3:1:1，v:v:v）定容，配制成浓度为0.1mg/ml的混合标准溶液ⅱ。于0℃～4℃冰箱中避光保存，有效期6个月。

标准工作溶液：准确移取25、50、100、250、500、750μl的混合标准溶液ⅱ，置于各自的25ml容量瓶中，然后准确加入250μl内标溶液，以正己烷/乙酸乙酯/异丙醇（3:1:1，v:v:v）定容至刻度，即得系列标准工作溶液。配制的系列标准溶液浓度为：1、2、4、10、20、50mg/kg。

取标准工作溶液进行gc/ms分析，纵坐标为各被分析物的定量离子峰面积与内标物定量离子峰面积的比值，横坐标为各被分析物浓度，取其中至少5点，做各被分析物的标准工作曲线。18种paes在1~50mg/kg的浓度范围内线性良好，相关系数从0.9978-0.9999。

选取试验用阳性样品，进行加标回收率实验，加标量分别为2，10，40mg/kg，每个加标水平上均平行测定5次，取平均值，并计算5次平行测定的相对平均标准偏差（rsd），由此得到18种paes在不同加标水平上的平均回收率和rsd，具体结果见表2。

由表2可得，18种paes在低、中、高3各加标条件下的回收率范围在90.2~105.8%，回收率良好；平均rsd均小于8%，测定精密度良好。

选取试验用阳性样品，以标准曲线最低杯浓度进行加标，重复测定10次，计算测定结果的sd，以3sd和10sd分别作为方法的检出限（lod）和定量限（loq），结果见表3。

（8）本发明存在的优势与说明：

采用50%（体积百分比）的乙醇溶液对待测样品进行分散和初步提取，相对于现存标准中采用乙醇对样品进行提取，大多数样品分散得更好。这是因为，香精香料有些是溶于水不溶于乙醇的，而有些是只溶于乙醇的，还有少数样品是乙醇和水都不溶的，采用50%乙醇溶液（乙醇和水的比例为1:1）对样品进行分散溶解，在实践中可以实现大多数香精香料样品的良好溶解，这就起到了更好的分散作用，相当于基质的破坏更为彻底，待测成分可以更好的溶出。

采用特定比例的正己烷/乙酸乙酯/异丙醇混合溶剂对乙醇水溶液进行液液萃取，相对于现行标准中直接采用乙醇提取进样，具有除杂质和保护分析仪器的双重功效。这是因为，液液萃取分层，乙醇水溶液在下层，特定比例的正己烷/乙酸乙酯/异丙醇在上层，此步骤相当于一个净化步骤，香精中很多干扰物都没有被萃取到最终进样溶液中，起到了一定程度的净化效果（具体看图3-图5）；另一方面，由于正己烷/乙酸乙酯/异丙醇溶液极性较乙醇弱，因此，更适合非极性分析柱的进样要求。更干净，极性更弱的进样溶液可以更大化的避免分析柱和离子源受到污染。

采用体积比例为3:1:1的正己烷/乙酸乙酯/异丙醇溶液对初提溶液进行液液萃取，可以使待测的18种paes的测定回收率均高于90%。这是因为，之前有文献报道烟用纸张中paes的测定，是采用水浸泡，乙醇初提，后采用正己烷进行液液萃取（唐纲岭，边照阳，杨飞，等.烟用接装纸、内衬纸和卷烟条与盒包装纸中18种邻苯二甲酸酯的测定[j].烟草科技，2012（9）：36-40.），由于paes中的dmp和dep碳链都很短，具有一定的极性，在水中都具有一定的溶解度，因此，在正己烷中溶解度较差，提取效率很低（张泽明，张洪海，李建龙，等.固相微萃取-气相色谱-质谱联用测定海水与沉积物中邻苯二甲酸酯类污染物[j].分析化学，2017，45（3）：348-356.）；而对于dehp和dnp等极性较弱的化合物，只有在正己烷中才具有最佳的溶解性，采用体积比为3:1:1的正己烷/乙酸乙酯/异丙醇溶液，可以实现18种成分的较好提取，加标样所有成分的回收率均可达到90%以及上（见表2）。

在测定中，将离子源温度设置为280℃及以上，可以有效避免杂质对于离子源的污染。现在很多方法都按照离子源的常规温度设置来操作，如安捷伦仪器离子源温度较为常规的设置为230℃，在很多测定paes的标准方法中也都没有强调离子源温度，其实，paes类化合物很容易污染离子源，特别是在样品净化不完全的条件下。提高离子源温度，可以将样品离子化更为完全，降低离子源的清洗频率。

附图说明

图1为本发明中标准溶液的色谱图；

该图中：1-dmp2-dep3-dap4-dibp5-dbp6-dmep7-bmpp8-deep9-dpp10-dhxp11-bbp12-dbep13-dchp14-dehp15-邻苯二甲酸二苯酯16-dnop17-dinp18-dnpis-内标。

图2为本发明中加标样品测定的色谱图，

该图中：1-dep2-dap3-dbpis-内标。

图3采用行业推荐方法和本发明中方法测定同一样品dibp的选择离子谱图，

其中a为行业推荐方法，b为本发明中方法。

图4采用行业推荐方法和本发明中方法测定同一样品dbp的选择离子谱图，

其中a为行业推荐方法，b为本发明中方法。

图5采用行业推荐方法和本发明中方法测定同一样品氘代dbp（内标）的选择离子谱图，

其中a为行业推荐方法，b为本发明中方法。

具体实施方式

本发明以下结合实施例做进一步描述：

实施例：烟用香精香料样品中邻苯二甲酸酯的测定。

（1）前处理

称取0.3-0.6g香精香料样品至25ml具塞三角瓶中，准确至0.0001g，加入7-15ml乙醇水溶液（体积比为1:1），再加入250µl内标溶液（溶剂为乙醇，浓度为0.1mg/ml），超声萃取30min，取2ml初提溶液至15ml玻璃离心管中，加入5ml正己烷/乙酸乙酯/异丙醇溶液（体积比为3:1:1），在2000rpm的条件下涡旋振荡5min，后在4000转/分钟条件下离心5min，取上层清液，待测。

（2）空白实验

不加样品，重复（1）步骤。

（3）仪器分析

采用gc-ms测定，测定条件如下。

气相色谱条件：

色谱柱固定相：5%苯基/95%甲基聚硅氧烷；规格：[30m（长度）×0.25mm（内径）×0.25μm（膜厚）]。

进样口温度：280℃；进样量：1μl，分流进样（分流比：10:1）；载气：氦气（纯度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0ml/min；升温程序：初始温度60℃，保持1min，以20℃/min的速率至220℃，保持1min，再以5℃/min的速率至280℃，保持15min。

质谱条件：

电离方式：电子轰击源（ei）；电离能量：70ev；传输线温度：280℃；离子源温度：280℃及以上；四极杆温度：150℃；测定方式：选择离子监视方式（sim）扫描；溶剂延迟：6min。各化合物sim条件见表1。

4）标准溶液的配制

混合标准溶液ⅰ：分别称取0.02g（精确至0.1mg）各种paes标准品，置于同一10ml容量瓶中，用正己烷/乙酸乙酯/异丙醇（3:1:1，v:v:v）溶解并定容，配制成浓度为2mg/ml的混合标准溶液ⅰ。于0℃～4℃冰箱中避光保存，有效期6个月。

混合标准溶液ⅱ：准确移取0.5ml混合标准溶液ⅰ，置于10ml容量瓶中，以正己烷/乙酸乙酯/异丙醇（3:1:1，v:v:v）定容，配制成浓度为0.1mg/ml的混合标准溶液ⅱ。于0℃～4℃冰箱中避光保存，有效期6个月。

标准工作溶液：准确移取25、50、100、250、500、750μl的混合标准溶液ⅱ，置于各自的25ml容量瓶中，然后准确加入250μl内标溶液，以正己烷/乙酸乙酯/异丙醇（3:1:1，v:v:v）定容至刻度，即得系列标准工作溶液。配制的系列标准溶液浓度为：1、2、4、10、20、50mg/kg。

5）取标准工作溶液进行gc/ms分析，纵坐标为各被分析物的定量离子峰面积与内标物定量离子峰面积的比值，横坐标为各被分析物浓度，取其中至少5点，做各被分析物的标准工作曲线。根据标准曲线得到被烟用香精香料中待测成分的含量。以两次平行测定的平均值为最终测定结果，精确至1mg/kg。

此例中具体结果见表4，色谱图见附图2。

表4样品含量