一种双核铀酰配合物在ATP分析中的应用的制作方法

本发明涉及生物化学分析检测方法技术领域，具体涉及一种双核铀酰配合物在atp分析中的应用。

背景技术

三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，atp)是一种高能化合物，是生物体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源，能够储存和传递化学能，参与体内蛋白质、脂肪、糖和核酸的代谢。atp在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用，可以作为细胞活性的一个重要标志物。atp也常作为检测微生物污染的一个指标。

目前已有的atp检测方法大抵操作繁琐，耗时长，制备过程复杂，对仪器设备要求高，精度低等缺点。因此，探索新的、灵敏度高的、快速便捷的检测方法对于检测atp在食品、药品、环境水样中的微生物污染情况等具有十分重要的意义。

技术实现要素：

在光谱分析检测方法中，二级散射(second-orderscattering,sos)是一种新发展起来的分析技术，因其灵敏度高，简单便捷的优点引起人们的关注，已被用于各种目标分析物的检测。与其他分析法相比较，sos法线性关系好，线性范围宽，是一种新的光谱分析检测方法。我们在研究中发现，在中性条件下，双核铀酰配合物(binuclearuranyl-isophthalaldehyde-tetrapyrrole,buiptp)与atp能形成一种配合物体系，对体系进行光谱性能测试，发现在体系激发波长的二倍处出现一个强峰，激发波长位于283nm处，在最大激发波长处，体系的sos强度随着atp的浓度的增加存在着线性关系，可用于痕量分析，且该方法具有较高的灵敏度，检出限为0.75nmol·l^-1，其灵敏度较常见的检测atp的方法要大大的提高。本发明研究了双核铀酰配合物(buiptp)与atp的配位反应对二级散射强度的影响，并对反应条件进行一系列的优化，得出的结果让人满意。

本发明提供一种双核铀酰配合物在atp分析中的应用，就是创造性地利用双核铀酰配合物用于二级散射方法，以可以解决现有技术中的上述问题。

本发明提供了一种双核铀酰配合物在atp分析中的应用，所述双核铀酰配合物为buiptp，该应用包括以下步骤：

步骤1，确定检测atp的最优条件：

1-1，在比色管中加入已知浓度的atp溶液得到待测atp溶液；

1-2，配制buiptp检测底液；

1-3，配制标准品溶液：

在搅拌下将buiptp检测底液滴加到待测atp溶液中，得到atp标准溶液；

1-4，用荧光分光光度计测定不同激发波长下atp标准溶液二级散射光谱强度，确定检测atp的最佳波长；

1-5，配制不同ph的缓冲溶液，将不同ph的缓冲溶液加入atp标准溶液中，在最佳波长下测定体系二级散射光谱，确定检测atp的最佳ph；

1-6，将atp标准溶液孵育0-50min，在最佳波长及ph条件下测定二级散射光谱，确定检测atp的最佳孵育时间；

1-7，在最优条件下，检测不同浓度的atp的二级散射光谱；

步骤2，绘制测定atp的标准曲线：

以atp的浓度为横坐标，以二级散射光强度为纵坐标绘制测定atp的标准曲线；

步骤3，样品中atp含量的分析：

3-1，称取含有atp的待测样品，加水溶解或稀释，并加入缓冲液以达到最佳ph，得到待测样品溶液；

3-2，在搅拌下将buiptp检测底液滴加到待测样品溶液中，得到标准品溶液，孵育0-50min；

3-3，在最佳波长处测定孵育后的标准品溶液的二级散射光谱强度；

3-4，从标准曲线中查找出所述样品中的atp浓度，并计算出样品中的atp含量。

所述buiptp的结构式如下：

较佳地，配制buiptp检测底液的过程为：准确称取buiptp固体，加入二次蒸馏水溶解，转移至容量瓶，定容，摇匀即得。

较佳地，步骤1-7中的待测atp溶液的浓度分别为0,50,100,200,300,400和500nmol·l^-1。

较佳地，步骤1-4确定的最佳波长为：激发波长283nm、发射波长为566nm，步骤1-5确定的最佳ph为7，所述缓冲溶液为tris-hcl缓冲液，步骤1-6确定的最佳孵育时间为30min。

较佳地，步骤3-2中的孵育时间为30min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：利用本发明所提供的检测方法检测的atp的浓度，与客观浓度的偏差小于2.5％。可证实本发明所提出的检测方法具有很高的精准度。利用本发明所提供的检测方法检测的atp的浓度，可在低至0.75nmol·l^-1时仍能检出。可证实本发明所提出的检测方法具有很低的检出限。利用本发明所提供的检测方法检测的atp的浓度，在2.5-500nmol·l^-1范围内具有良好的检测效果。

附图说明

图1为本发明的atp与buiptp反应和检测atp的过程示意图；

图2为buiptp与不同浓度的atp溶液的二级散射光谱图：

其中a-g分别表示atp的浓度为0,50,100,200,300,400,500nmol·l^-1；

图3为本发明的实施例3测定atp的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的双核铀酰配合物在atp分析中的应用的原理如图1所示：buiptp与atp能形成一种配合物体系，对该体系进行光谱性能测试，发现在体系激发波长的二倍处出现一个强峰，激发波长位于283nm处，在最大激发波长处，体系的sos强度随着atp的浓度的增加存在着线性关系。

本发明中的buiptp的制备过程如下：

(1)于250ml圆底烧瓶加入0.12mol·l^-1盐酸100ml，加入60mmol吡咯、5mmol相应的芳醛，磁子搅拌下常温避光反应，对反应体系进行了tlc实时监测。控制合适的反应时间，当tlc监测反应底物芳醛基本完全消耗后，结束反应，用氨水将反应液中和至ph＝8-9，过滤，并用石油醚不断冲洗至滤液无色。将抽滤所得同体少许送hplc监测其各组成含量，其余固体可以用乙酸乙酯-石油醚重结晶，得到纯的二吡咯甲烷后，减压干燥即得配体。

(2)将iptp(0.3660g，1.0mmol)和六水合硝酸铀酰(0.5020g，1.0mmol)溶解在100ml无水乙醇/水(3:1，v/v)溶液中，将混合物室温下用磁子搅拌10h使其发生螯合反应。将溶剂减压除去，得到的固体用无水乙醇洗涤数次，然后用柱层析进行提纯，所得产物即为纯的buiptp。

实施例1：检测atp的最优条件的确定

(1)在10ml比色管中加入3ml浓度为500nmol·l^-1的atp溶液。

(2)配制buiptp检测底液：

用分析天平准确称量buiptp固体0.7400g，加入二次蒸馏水溶解，转移至100ml容量瓶，加水定容至刻度线，摇匀，即得10μmol·l^-1的buiptp检测底液。

(3)配制标准品溶液：在搅拌下将5ml的10μmol·l^-1的buiptp检测底液滴加上述步骤(1)的溶液中。

1.1最大激发波长的确定

用荧光分光光度计在不同激发波长下测定上述标准品溶液的二级散射光谱强度(isos)，比较得出最大激发波长为283nm，最大发射波长为566nm。

1.2最佳ph的确定

配制ph为4～9的一系列缓冲溶液，将不同ph的缓冲溶液加入到含有atp以及buiptp的溶液中，在激发波长为283nm处测定体系的二级散射光谱；实验得出体系最佳ph为7，对应的缓冲溶液是tris-hcl缓冲溶液。

1.3最佳反应时间的确定

在最大激发波长和最佳ph条件下，测定体系的二级散射光谱；实验得出体系最佳反应时间是30min。

实施例2：二级散射实验

(1)在10ml比色管中加入3ml的atp溶液以及2ml的tris-hcl缓冲液(ph＝7)，得到atp的浓度(c)分别为0,50,100,200,300,400和500nmol·l^-1的七个待测溶液。

(2)配制buiptp检测底液：

用分析天平准确称量buiptp固体0.7400g，加入二次蒸馏水溶解，转移至100ml容量瓶，加水定容至刻度线，摇匀，即得10μmol·l^-1的buiptp检测底液。

(3)配制标准品溶液：在搅拌下将5ml的10μmol·l^-1的buiptp检测底液滴加到每个待测溶液中，得到对应的七个标准品溶液，总滴加时间为10min，孵育30min。

其中，我们经过实验得知：将buiptp滴加到含有atp的待测样品溶液时的二级散射信号比将含有atp的待测样品溶液滴加到buiptp溶液时的更强。

(4)用荧光分光光度计在激发波长283nm，发射波长566nm处测定该七个标准品溶液的二级散射光谱强度(isos)。

(5)绘制二级散射光谱图：对上述七个标准品溶液，以波长为横坐标，以二级散射光强度(isos)为纵坐标绘制二级散射光谱图，如图2所示。从图2可以看出，当体系中不存在atp时，溶液的二级散射强度较弱。当加入atp溶液后，体系的二级散射强度增强。在最佳条件下，buiptp-atp体系二级散射增加的强度与一定范围的atp浓度呈现线性关系。因此，可以利用由atp和buiptp引起的反应来建立一种以二级散射光谱法检测atp的方法。

实施例3：标准曲线的绘制

(1)在10ml比色管中加入3ml的atp溶液以及2ml的tris-hcl缓冲液(ph＝7)，得到atp的浓度(c)分别为0,50,100,200,300,400和500nmol·l^-1的七个待测溶液。

(2)配制buiptp检测底液：

用分析天平准确称量buiptp固体0.7400g，加入二次蒸馏水溶解，转移至100ml容量瓶，加水定容至刻度线，摇匀，即得10μmol·l^-1的buiptp检测底液。

(3)配制标准品溶液：在搅拌下将5ml的10μmol·l^-1的buiptp检测底液滴加到每个待测溶液中，得到对应的七个标准品溶液，总滴加时间为10min，孵育30min。

(4)用荧光分光光度计在激发波长283nm，发射波长566nm处测定该七个标准品溶液的二级散射光谱强度(isos)。

(5)绘制标准曲线：以atp的浓度(c)为横坐标，以二级散射光强度(isos)为纵坐标绘制标准曲线，如图3所示。

实施例4：实际样品检测实验

我们对四种含有atp的待测样品(药片1、药品2、注剂1、注剂2)的atp含量进行了分析，结果如表1所示：

表1实际样品分析(n＝6)

表1中的平均值是药片或注剂本身的atp的浓度，加入量指的是在药片和药剂已有浓度下再加入的atp浓度，检测量是实验所测得的总的atp浓度。

从表1可以看出样品平行测定的rsd(相对标准偏差)都低于2.5％，实验回收率在99.0-101.0％范围内(n＝6，为平行实验次数)。结果表明，该研究方法可以成功应用于实际样品中atp的检测，并且具有较好的回收率。

实施例5：共存物质影响实验

我们在最优实验条件下，对不同浓度atp的二级散射强度进行了测定，并作出了标准曲线，如图3所示，该标准曲线表明，atp浓度在2.5-500nmol·l^-1范围内，二级散射强度(isos)与atp浓度(c)之间具有良好的线性关系。线性回归方程为：δisos＝548+7.98c(nmol·l^-1)，相关系数r＝0.9991。平行测定11份空白溶液，根据检出限公式lod＝3sb/m(sb为空白标准偏差，m为工作曲线的斜率)，检出限为0.75nmol·l^-1。分别对atp浓度为100nmol·l^-1和300nmol·l^-1两组待测液进行六次平行测定，相对标准偏差分别为2.56％和2.03％。

另外，我们还研究了共存物质对检测体系的影响，具体如下：

在选定条件下，我们对体系进行了共存物质影响的干扰情况研究。结果见表2，表2中所列的相对误差在±5％的范围内，基本对atp的测定无干扰。

表2共存物质的影响

本发明的有益效果是：利用本发明所提供的检测方法检测的atp的浓度，与客观浓度的偏差小于2.5％。可证实本发明所提出的检测方法具有很高的精准度。利用本发明所提供的检测方法检测的atp的浓度，可在低至0.75nmol·l^-1时仍能检出。可证实本发明所提出的检测方法具有很低的检出限。利用本发明所提供的检测方法检测的atp的浓度，在2.5-500nmol·l^-1范围内具有良好的检测效果。

本发明中涉及的未说明部分与现有技术相同或采用现有技术加以实施。

以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。