本发明涉及一种蜘蛛果药材中绿原酸、木犀草素和芹菜素的含量测定方法，属于药品技术的领域。
背景技术：
中药多成分、多靶点的特性决定了中药质量控制模式必须是多成分定量和多指标监控。目前，一测多评法已广泛应用于中药材及中药制剂的质量控制研究中，“一测多评”(QAMS)法是现代发展起来并广泛应用的一种分析技术和方法，即利用有效化学成分间内在的函数关系和比例关系，测定1个成分(对照品可廉价易得者)，来实现对多个成分(对照品没有或难以得到者)的同步监控，使中药质量评价更简便并节约成本，可客观评价中药的质量。
蜘蛛果来源于桔梗科CampanuLaceae金钱豹属Campanumoea多年生植物长叶轮钟草Campanumoea lancifolia(Roxb.)Kurz的干燥根，又称“红果参”、“山荸荠”、“算盘果”等。蜘蛛果药材为2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》修订的新增补品种，味甘而微苦，性平，具有润肺止咳、理气、补虚、祛瘀止痛等功效，主要用于治疗跌打损伤、气虚乏力、肠绞痛、肺痨咳嗽、疝气等症。其根在民间常作为滋补草药，嫩叶可作为蔬菜炒食，果实可作为水果食用，有一定的保健功效。通过文献查阅分析，目前对蜘蛛果药材的研究报道相对较少，主要集中在其化学成分及抗氧化活性的研究，在质量控制方面仍处于空白，不利于控制药材及其成方制剂的质量，无法保证临床用药的安全性和有效性，并限制了对蜘蛛果的进一步开发利用。
技术实现要素：
本发明目的在于，提供一种蜘蛛果药材中绿原酸、木犀草素和芹菜素的含量测定方法。本发明采用HPLC法，通过对提取方法及色谱条件的优化，建立一测多评法测定蜘蛛果药材中活性成分的含量，为该药材质量标准的制定、合理开发利用资源等提供研究基础。所述测定方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，为蜘蛛果药材质量控制和评价提供依据。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：一种蜘蛛果药材中绿原酸、木犀草素和芹菜素的含量测定方法，所述含量测定方法为：
色谱条件：色谱柱：Pntulips BP-C18(4.6mm×250mm，2.5μm)；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱；检测波长：330～350nm；柱温：20～30℃；流速：0.8～1.2mL·min-1；进样量：5～15μL；
绿原酸对照品储备液的制备：取绿原酸对照品，加50％甲醇溶解并制成质量浓度为1.4046～1.4054mL·min-1的溶液；
木犀草素对照品储备液的制备：取木犀草素对照品，加50％甲醇溶解并制成质量浓度为0.2015～0.2025mL·min-1的溶液；
芹菜素对照品储备液的制备：取芹菜素对照品，加50％甲醇溶解并制成质量浓度为0.2055～0.2065mL·min-1的溶液；
混合对照品溶液的制备：分别吸取上述各对照品储备液2.0mL、2.5mL、0.5mL，置与5mL的容量瓶中，定容，得绿原酸、木犀草素、芹菜素浓度分别为0.5620mL·min-1、0.1010mL·min-1和0.02060mL·min-1的混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：取药材粉末0.8～1.2g，精密称定，置于50mL锥形瓶中，精密加入45～55％甲醇溶液10～15mL，超声提取后，取出放至室温，滤过，续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
含量测定：精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即可。
前述的蜘蛛果药材中绿原酸、木犀草素和芹菜素的含量测定方法中，梯度洗脱程序为：0～5min，2％～12％A，3％～8％B，95％～80％C；5～15min，12％～6％A，8％～14％B，80％～80％C；15～20min，6％～16％A，14％～10％B，80％～74％C；20～25min，16％～22％A，10％～8％B，74％～70％C；25～35min，22％～34％A，8％～16％B，70％～50％C；35～40min，34％～0％A，16％～100％B，50％～0％C；40～45min，0％A，100％B，0％C。
前述的蜘蛛果药材中绿原酸、木犀草素和芹菜素的含量测定方法中，所述的超声提取是：在功率100W，频率40Hz下超声提取50～70min。
前述的蜘蛛果药材中绿原酸、木犀草素和芹菜素的含量测定方法中，所述检测波长：340nm；柱温：25℃；流速：1mL·min-1。
前述的蜘蛛果药材中绿原酸、木犀草素和芹菜素的含量测定方法中，所述的供试品溶液这样制备：取药材粉末1.0g，精密称定，置于50mL锥形瓶中，精密加入50％甲醇溶液10mL，超声提取后，取出放至室温，滤过，续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
发明人进行了大量的实验，以下是部分实验研究
实验例1.含量测定方法考察
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent 1100型和1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；岛津LC-2030型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Thermo UItiMate 3000型高效液相色谱仪(美国赛默飞公司)；AG135型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；SG8200HFT型超声仪(上海冠特超声仪器有限公司)；202-1A型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；DK-98-II型水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；色谱柱：Agilent HC-C18(4.6mm×250mm，5μm)；Agilent ZORBAX XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；Agilent ZORBAX Extend-C18(4.6mm×250mm，5μm)；Aglent ZORBAXSB-C18(4.6mm×150mm，5μm)；Agilent ZORBAXSB-CN(4.6mm×250mm，5μm)；Pntulips BP-C18(4.6mm×250mm，5μm)等。
1.2试药
绿原酸对照品(批号：110753-201716，含量以99.3％计)，木犀草素对照品(批号：111520-201605；含量以99.6％计)，芹菜素(批号：111901-201603；含量以99.2％计)均购于中国食品药品检定研究院；甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)，乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)，磷酸(重庆川东化工有限公司，分析纯)，实验用水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯；
17批蜘蛛果药材分别由课题组采自贵州龙里、独山、开阳、梵净山以及广西省融水等地，经贵阳中医学院孙庆文教授准确鉴定为长叶轮钟草C.lancifolia(Roxb.)Kurz。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱为Pntulips BP-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-甲醇(B)-0.1％磷酸水溶液(C)，洗脱程序见表1。流速为1.0mL·min-1；检测波为340nm；柱温为25℃；进样量为10μL。
表1流动相洗脱程序
2.2对照品溶液的制备
取绿原酸对照品、木犀草素对照品、芹菜素对照品适量，加50％甲醇溶解并制成质量浓度分别为1.4050mg·mL-1、0.2020mg·mL-1、0.2060mg·mL-1的对照品储备液；再分别吸取各对照品储备液2.0mL、2.5mL、0.5mL，置与5mL的容量瓶中，定容，得绿原酸、木犀草素、芹菜素浓度分别为0.5620mg·mL-1、0.1010mg·mL-1、0.02060mg·mL-1的混合对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备
取药材粉末1.0g，精密称定，置于50mL锥形瓶中，精密加入50％甲醇溶液10mL，超声提取(100W，40Hz)60min，取出放至室温，滤过，续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
2.4专属性考察试验
精密吸取上述混合对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果表明，供试品图谱中1、2、3号色谱峰的保留时间与混合对照品溶液中绿原酸、木犀草素、芹菜素色谱峰的保留时间一致，且UV光谱图曲线相同，其纯度因子依次为999.916、999.891、999.155峰纯度良好，表明该方法具有良好的专属性，结果见图1。
2.5标准曲线的绘制
精密吸取“2.2”项下的各成分的单一对照品溶液，分别稀释成系列浓度的对照品溶液(绿原酸：0.3513mg·mL-1、0.1756mg·mL-1、0.08780mg·mL-1、0.04390mg·mL-1、0.02200mg·mL-1；木犀草素：0.1010mg·mL-1、0.05050mg·mL-1、0.02525mg·mL-1、0.01262mg·mL-1、0.006312mg·mL-1；芹菜素：0.04120mg·mL-1、0.01648mg·mL-1、0.006592mg·mL-1、0.002637mg·mL-1、0.0005274mg·mL-1)，按“2.1”项下色谱条件进行测定，平行测定3次，以对照品进样量为横坐标(x)，峰面积平均值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，进行线性回归，得绿原酸、木犀草素、芹菜素的回归方程及相关系数，结果见表2和图2。
表2蜘蛛果药材中3个成分回归方程、相关系数和线性范围(n＝5)
2.6待测成分校正因子的测定
照“2.1”项下的色谱条件，取“2.2”项下混合对照品溶液，精密吸取2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL注入高效液相色谱仪进行测定，以绿原酸为内参物，根据校正因子计算公式fsi＝fs/fi＝(As×Ci)/(Ai×Cs)，该公式中As、Cs分别为内参物的峰面积和浓度；Ai、Ci分别为待测成分的峰面积和浓度；fsi为待测成分的相对校正因子。分别计算绿原酸对木犀草素和芹菜素的相对校正因子(fS/B为木犀草素的相对校正因子，fS/C为芹菜素的相对校正因子)，其RSD均小于5.0％(见表3)。
表3木犀草素、芹菜素校正因子计算结果(n＝6)
2.7精密度试验
精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10μL，照“2.1”项下的色谱条件，连续进样6次，测得峰面积值，计算峰面积的RSD值，绿原酸、木犀草素、芹菜素的RSD值分别为0.26％、0.74％、0.26％，均小于2.0％，表明仪器精密度良好。结果见表4和图3。
表4精密度试验结果(n＝6)
2.8重复性试验
取同一蜘蛛果样品(Z7号)6份，每份约1.0g，精密称定，按“2.3”项方法制备供试液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算绿原酸、木犀草素、芹菜素平均质量分数分别为0.59％、0.097％、0.020％，其RSD值分别为2.6％、1.4％、1.4％，结果表明该方法重复性良好。结果见表5和图4。
表5重复性试验结果(n＝6)
2.9稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液(Z7号)，分别于0、3、6、8、12、24小时注入高效液相色谱仪进行分析，按“2.1”项下依法测定绿原酸、木犀草素、芹菜素的峰面积值，并计算三种成分的含量，其RSD值分别为0.67％、1.5％、1.9％，表明供试品溶液在48h内较稳定。结果见表6和图5。
表6稳定性试验结果(n＝7)
2.10加样回收率试验
取已知含量的蜘蛛果药材粉末(Z7号)6份，每份约0.5g，精密称定，分别精密加入绿原酸、木犀草素、芹菜素对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别测定，分别计算绿原酸、木犀草素、芹菜素的平均回收率依次为96.00％、96.34％、95.93％，RSD值依次为1.5％、2.4％、2.5％，表明本方法测定结果准确度高。结果见表7和图6。
表7加样回收率试验结果(n＝6)
2.11不同仪器及色谱柱对相对校正因子的影响
本实验考察了4个实验室中4种型号的高效液相色谱仪和3种不同型号的C18色谱柱。分别精密吸取“2.2”项下制备的混合对照品10μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算木犀草素、芹菜素的相对校正因子，分别在0.578～0.617、0.471～0.551之间，不同型号仪器和色谱柱所得相对校正因子RSD值分别为2.2％和3.8％，表明不同型号仪器和不同型号色谱柱对各成分的相对校正因子无显著性影响，结果见表8。
2.12待测组分色谱峰的定位参数考察
建立QAMS法目的在于利用一种对照品(即可测定其他待测成分的含量)，利用待测成分木犀草素、芹菜素对绿原酸的保留时间差或相对保留时间作为定位标准，本实验考察4个实验室中不同型号的仪器和色谱柱下的保留时间差和相对保留时间，实验结果表明不同型号仪器和色谱柱对各成分保留时间差波动较小，RSD值分别为1.9％和3.0％，相对保留时间差异较大，RSD值分别为6.3％和5.4％，因此采用保留时间差法定位木犀草素、芹菜素色谱峰，结果见表8。
表8相对校正因子、保留时间差和相对保留时间考察结果(n＝3)
2.13样品测定
取蜘蛛果药材样品，共计21个批次，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样测定，测得绿原酸、木犀草素、芹菜素峰面积，分别采用ESM法和QAMS法，计算干品蜘蛛果药材中木犀草素和芹菜素的含量，并对两种方法测定结果进行比较，结果见表9和图5。
表9 21批次蜘蛛果药材样品测定结果(n＝3)
注：-为未检测出该成分
3结论
本实验对ESM法和QAMS法计算的蜘蛛果药材中木犀草素、芹菜素两种成分的含量进行比较，进行独立样本t检验结果P>0.05，显示两种测定方法所得的两种成分的量无显著性差异，结果准确可靠，进一步验证了QAMS法测定蜘蛛果药材中绿原酸、木犀草素、芹菜素的含量是可行的，各成分以其保留时间差定位，木犀草素和芹菜素的保留时间差/相对校正因子分别为24.02/0.604、26.71/0.525。QAMS法与ESM法测定蜘蛛果药材中三种成分的含量无显著性差异，因此，本实验所建立的蜘蛛果药材中绿原酸、木犀草素、芹菜素的含量测定方法简便快速、准确可行，可用于测定蜘蛛果药材中绿原酸、木犀草素、芹菜素的含量，为其质量控制标准的研究奠定一定的实验基础。
本发明本发明采用HPLC法，通过对提取方法及色谱条件的优化，建立一测多评法测定蜘蛛果药材中活性成分的含量，为该药材质量标准的制定、合理开发利用资源等提供研究基础。所述测定方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，为蜘蛛果药材质量控制和评价提供依据。
附图说明
图1是专属性考察HPLC色谱及UV光谱图(其中a：对照品溶液；b：供试品溶液；c：空白溶液；1-绿原酸色谱峰及UV光谱图；2-木犀草素色谱峰及UV光谱图；3-芹菜素色谱峰及UV光谱图)；
图2是绿原酸、木犀草素、芹菜素标准曲线图；(a)是绿原酸标准曲线图；(b)是木犀草素标准曲线图；(c)是芹菜素标准曲线图；
图3是精密度试验HPLC色谱叠加图；
图4是重复性试验HPLC色谱叠加图；
图5是稳定性试验HPLC色谱叠加图；
图6是加样回收率试验HPLC色谱叠加图；
图7是21批蜘蛛果药材样品HPLC色谱叠加图。
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1：
一种蜘蛛果药材中绿原酸、木犀草素和芹菜素的含量测定方法：
色谱条件：Pntulips BP-C18柱(4.6mm×250mm，2.5μm)；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为甲醇，流动相C为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱；检测波长：340nm；柱温：25℃；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL；梯度洗脱程序洗脱程序为：0～5min，2％～12％A，3％～8％B，95％～80％C；5～15min，12％～6％A，8％～14％B，80％～80％C；15～20min，6％～16％A，14％～10％B，80％～74％C；20～25min，16％～22％A，10％～8％B，74％～70％C；25～35min，22％～34％A，8％～16％B，70％～50％C；35～40min，34％～0％A，16％～100％B，50％～0％C；40～45min，0％A，100％B，0％C。
绿原酸对照品储备液的制备：取绿原酸对照品，加50％甲醇溶解并制成质量浓度为1.405mg/mL的溶液；
木犀草素对照品储备液的制备：取木犀草素对照品，加50％甲醇溶解并制成质量浓度为0.2020mg/mL的溶液；
芹菜素对照品储备液的制备：取芹菜素对照品，加50％甲醇溶解并制成质量浓度为0.2060mg·mL的溶液；
混合对照品溶液的制备：分别吸取上述各对照品储备液2.0mL、2.5mL、0.5mL，置与5mL的容量瓶中，定容，得绿原酸、木犀草素、芹菜素浓度分别为0.5620mg/mL、0.1010mg/mL和0.02060mg/mL的混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：取药材粉末1.0g，精密称定，置于50mL锥形瓶中，精密加入50％甲醇溶液10mL，超声提取后，取出放至室温，滤过，续滤液过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
HPLC法测定：分别吸取对照品溶液和供试品溶液分别进样，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，测得峰面积值并计算含量，即可。