一种河豚毒素标准生物样品的制备方法与流程

本发明涉及一种河豚毒素标准生物样品的制备方法。
背景技术：
：河鲀毒素(tetrodotoxin，ttx)是一种毒性极强的非蛋白类神经毒素，存在于河鲀(tetraodontidae)和其它多种海洋生物体内。其作为镇痛药物和麻醉剂，在医药上用途广泛，水产动物源食品检测领域也需要ttx标准品。由于在净化和制备技术和工艺上存在难点，高纯度的ttx标准品供不应求。ttx制备主要依靠从生物材料中提取的方法获取，经过多步的纯化与浓缩步骤，从而获取高纯度的产品。传统的ttx标准样品制备流程多以河鲀鱼的内脏作为提取原料，用酸性溶剂提取，经过多种层析法除去杂质，结合多次重结晶和浓缩步骤获取高纯度的ttx产品。崔建洲等用醋酸水溶液提取河鲀肝脏中的ttx，采用d201和ir-86两种离子交换树脂对粗提取液进行净化处理，sephadexg-10葡聚糖凝胶除去蛋白质成分，用hplc对粗品进行分离纯化，得到纯度为99.5％的ttx产品。国内也有易瑞灶和陈伟珠借助膜分离技术，用hplc进行纯品分离制备，得到纯度为99％和97％的ttx产品。此外，还有利用海藻希瓦氏菌和梭形芽孢杆菌的细菌发酵法获取ttx产品。该方法可避免因获取原料而大量捕杀野生河鲀的问题，同时避免了对河鲀资源和生态平衡造成的破坏，且不受季节和地域的限制，但是利用细菌生产的ttx含量低，目前实际生产中难以大规模应用。ttx的化学结构比较复杂(见附图1)，人工合成存在较大难度，目前有关人工合成ttx技术的研究不多。日本学者kishi等于1972年首次研究了人工合成外消旋ttx，此后又有立体选择性合成和不对称合成ttx的人工合成方法的报道出现。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有ttx标准品制备工艺上存在技术的缺陷和难点，高纯度的ttx标准品供不应求的情况，提供一种高纯度的河豚毒素生物标准样品的制备方法，该方法制备过程与操作简单、高效，适用河豚毒素织纹螺生物标准样品的批量制备和生产。本发明所采取的技术方案是：一种河豚毒素标准生物样品的制备方法，是用乙酸甲醇溶液提取织纹螺样品，将粗提取液用碳纳米管固相萃取柱进行净化，净化的毒液进行高效液相色谱纯化，然后冷冻干燥浓缩，析出结晶，得到河豚毒素标准生物样品。这种河豚毒素标准生物样品的制备方法，包括以下步骤：1)织纹螺样品的提取：取经充分匀质的织纹螺样品与乙酸甲醇溶液混合，超声水浴提取，再移取上清液，在残渣中加入乙酸甲醇溶液，重复提取1次，合并两次的粗提取液，备用；2)碳纳米管固相萃取柱净化：移取步骤1)的粗提取液，用氨水调节ph，通过装填碳纳米管的固相萃取柱净化，然后挤干柱中液体，用甲醇、纯水依次淋洗，挤干萃取柱，再用乙酸-乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液，备用；3)制备液相纯化：将步骤2)收集的洗脱液，水浴旋转蒸发浓缩至体积不变，除去乙腈溶剂；浓缩的毒液按照制备高效液相色谱进样的条件纯化，根据标准溶液河豚毒素的出峰时间，确定样品中目标毒素组分采集时间，收集该段时间内的流出液；流出液旋转蒸发浓缩，用氨水调节ph，冷冻干燥至析出结晶，即河豚毒素标准生物样品。制备方法的步骤1)中，织纹螺样品与乙酸甲醇溶液的料液比为1∶(5～6)。制备方法的步骤1)中，乙酸甲醇溶液中乙酸的体积浓度为0.5％～1.5％。制备方法的步骤1)中，超声水浴提取的条件为：超声波功率150w～250w，超声波频率5khz～7khz，水浴温度50℃～70℃，提取时间10min～20min。制备方法的步骤2)中，装填碳纳米管的固相萃取柱使用前经活化处理，具体为：称取5g酸化处理的多壁碳纳米管，用甲醇作为分散剂，湿法装填于空的30ml小柱中，依次加入10ml乙酸-乙腈水溶液、10ml氨水活化和平衡小柱。制备方法的步骤2)中，乙酸-乙腈水溶液中乙酸的体积浓度为0.05％～0.15％，水和乙腈的体积比为8∶2；氨水的体积浓度为0.05％～0.15％。多壁碳纳米管的酸化处理具体为：取多壁碳纳米管粉末与硫酸、硝酸混合，超声振荡，静置后除去上层溶液，反复用水漂洗至中性，干燥后研磨，得到酸化处理的多壁碳纳米管。制备方法的步骤3)中，制备高效液相色谱进样的条件为：色谱柱：inertsustainamide制备柱，规格为20mm×250mm，直径为5μm；进样量：5ml；流速：6.00ml/min；柱温：35℃，紫外检测波长200nm；流动相a为乙腈，流动相b为0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～10min，10％～80％流动相b；10.0min～12.5min，80％流动相b；12.5min～16.0min，80％～10％流动相b；16.0min～25.0min，10％流动相b。制备方法的步骤2)或步骤3)中，用氨水调节ph为8.5～9.0。本发明的有益效果是：本发明从ttx提取、纯化和制备纯品方面切入，以织纹螺为原料，并通过乙酸甲醇提取、大体积碳纳米管固相萃取净化粗提液，后将毒液浓缩，用制备高效液相进样进行纯化制备。本发明样品制备方法与过程操作简便、高效，适用于批量生产、工艺化制备河豚毒素标准生物样品。具体如下：(1)本发明方法采用毒性高、来源稳定的织纹螺代替河鲀卵巢、肝脏等作为提取原料，酸化甲醇超声波辅助萃取高效提取毒素，大体积的自填装碳纳米管固相萃取小柱有效净化粗提取的毒液，制备液相纯化液，真空冷冻干燥浓缩，制成用于检测分析和比对验证需要的河豚毒素标准生物样品。(2)本发明通过单因素试验优化提取工艺(溶剂、料液比、提取方式、温度因素)，自填装碳纳米管固相萃取大体积净化条件优化(碳纳米管酸化处理、柱子填料填装量、固相萃取净化流程)，制备液相纯化工艺研究(色谱梯度分离条件、优化毒素流出液收集参数)，建立了一种河豚毒素标准生物样品的制备方法。标准样品制备过程简单、高效，适合批量制备和工艺化生产。附图说明图1是ttx结构式图；图2是不同萃取溶剂的提取率比较图；图3是甲醇中乙酸比例对ttx提取效果的影响曲线图；图4是不同温度下样品中ttx提取率的曲线图；图5是上样液不同ph值对回收率的影响曲线图；图6是不同配比洗脱液的解吸效果比较图；图7是ttx标准溶液色谱图。具体实施方式一种河豚毒素标准生物样品的制备方法，是用乙酸甲醇溶液提取织纹螺样品，将粗提取液用碳纳米管固相萃取柱进行净化，净化的毒液进行高效液相色谱纯化，然后冷冻干燥浓缩，析出结晶，得到河豚毒素标准生物样品。这种河豚毒素标准生物样品的制备方法，包括以下步骤：1)织纹螺样品的提取：取经充分匀质的织纹螺样品与乙酸甲醇溶液混合，超声水浴提取，再移取上清液，在残渣中加入乙酸甲醇溶液，重复提取1次，合并两次的粗提取液，备用；2)碳纳米管固相萃取柱净化：移取步骤1)的粗提取液，用氨水调节ph，通过装填碳纳米管的固相萃取柱净化，然后挤干柱中液体，用甲醇、纯水依次淋洗，挤干萃取柱，再用乙酸-乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液，备用；3)制备液相纯化：将步骤2)收集的洗脱液，水浴旋转蒸发浓缩至体积不变，除去乙腈溶剂；浓缩的毒液按照制备高效液相色谱(hplc)进样的条件纯化，根据标准溶液河豚毒素的出峰时间，确定样品中目标毒素组分采集时间，收集该段时间内的流出液；流出液旋转蒸发浓缩，用氨水调节ph，冷冻干燥至析出结晶，即河豚毒素标准生物样品。优选的，制备方法的步骤1)中，织纹螺样品与乙酸甲醇溶液的料液比为1∶(5～6)；进一步优选的，织纹螺样品与乙酸甲醇溶液的料液比为1∶5；织纹螺样品与乙酸甲醇溶液的料液比是指织纹螺样品的质量与乙酸甲醇溶液的体积比。优选的，制备方法的步骤1)中，乙酸甲醇溶液中乙酸的体积浓度为0.5％～1.5％；进一步优选的，乙酸甲醇溶液中乙酸的体积浓度为1.0％。进一步的，1％乙酸甲醇溶液的配制方法为：50ml乙酸与4.95l甲醇混合，4℃保存备用。优选的，制备方法的步骤1)中，超声水浴提取的条件为：超声波功率150w～250w，超声波频率5khz～7khz，水浴温度50℃～70℃，提取时间10min～20min；进一步优选的，超声水浴提取的条件为：超声波功率200w，超声波频率6khz，水浴温度60℃，提取时间15min。优选的，制备方法的步骤2)中，装填碳纳米管的固相萃取柱上样的粗提取液体积不大于200ml；洗脱所用乙酸-乙腈水溶液用量为柱床体积的8～12倍；进一步优选的，装填碳纳米管的固相萃取柱上样的粗提取液体积为200ml；洗脱所用乙酸-乙腈水溶液用量为柱床体积的10倍。优选的，制备方法的步骤2)中，装填碳纳米管的固相萃取柱使用前经活化处理，具体为：称取5g酸化处理的多壁碳纳米管，用甲醇作为分散剂，湿法装填于空的30ml小柱中，依次加入10ml乙酸-乙腈水溶液、10ml氨水活化和平衡小柱；进一步的，装填碳纳米管的固相萃取柱底部和上层填充垫片，保证填料柱床平整，通过性良好。优选的，制备方法的步骤2)中，乙酸-乙腈水溶液中乙酸的体积浓度为0.05％～0.15％，水和乙腈的体积比为8：2；氨水的体积浓度为0.05％～0.15％；进一步优选的，乙酸-乙腈水溶液中乙酸的体积浓度为0.1％，水和乙腈的体积比为8：2；氨水的体积浓度为0.1％。进一步的，0.1％乙酸-乙腈水溶液(8∶2，v/v)的配制方法为：200ml乙腈，加1ml乙酸，用纯水定容到1000ml，混合均匀，4℃保存备用。进一步的，0.1％氨水的配制方法为：500μl氨水，用纯水定容到500ml，混合均匀，4℃保存备用。优选的，多壁碳纳米管的酸化处理具体为：取多壁碳纳米管(mwcnts)粉末与硫酸、硝酸混合，超声振荡，静置后除去上层溶液，反复用水漂洗至中性，干燥后研磨，得到酸化处理的多壁碳纳米管；进一步的，多壁碳纳米管的酸化处理具体为：称取mwcnts粉末，于单口烧瓶中，加入60ml浓h2so4、120ml浓hno3，超声振荡1h，静置后除去上层溶液，反复用蒸馏水漂洗至中性，80℃真空干燥后研磨。优选的，制备方法的步骤3)中，洗脱液水浴旋转蒸发浓缩的温度为50℃～70℃。优选的，制备方法的步骤3)中，制备高效液相色谱进样的条件为：色谱柱：inertsustainamide制备柱，规格为20mm×250mm，直径为5μm；进样量：5ml；流速：6.00ml/min；柱温：35℃，紫外检测波长200nm；流动相a为乙腈，流动相b为0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～10min，10％～80％流动相b；10.0min～12.5min，80％流动相b；12.5min～16.0min，80％～10％流动相b；16.0min～25.0min，10％流动相b。优选的，制备方法的步骤2)或步骤3)中，用氨水调节ph为8.5～9.0。优选的，制备方法的步骤3)中，冷冻干燥的温度为-80℃～-85℃。通过步骤3)得到的河豚毒素标准生物样品溶解稀释后，用uplc-ms/ms进行纯度测定分析。进一步的，溶解稀释河豚毒素标准生物样品所用的溶剂为甲酸乙腈的水溶液，甲酸乙腈的水溶液中甲酸的体积浓度为0.1％，水和乙腈的体积比为1∶1。进一步的，uplc-ms/ms分析色谱柱：acquityuplc@behamide柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：40℃；进样量：10μl；流速：0.3ml/min；流动相：流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0min，5％～60％流动相a；1.0～3.0min，60％流动相a；3.0～3.2min，95％～5％流动相a；3.2～5min，5％流动相a。进一步的，uplc-ms/ms分析质谱条件为：电喷雾电离(esi)；扫描方式：正负离子同时扫描；离子源温度：150℃；毛细管电压：3.0kv；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流量：900l/h；碰撞气流速：0.15ml/min，锥孔反吹气流量：150l/h；监测方式：多反应监测(multiple-periodmrm)。以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。这些具体实施案例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。1仪器与试剂仪器：2545型制备液相配备2489uv检测器(美国waters公司)；acquityuplci-class/xevotqs超高效液相色谱仪串联三重四级杆质谱仪(配备电喷雾离子源及masslynx数据处理软件，美国waters公司)；alpha2-4lsc型真空冷冻干燥机(德国christ公司)；5810型台式离心机(德国eppendorf公司)；ms3旋涡混合器(德国ika公司)；n-evap氮吹仪(美国organomation公司)。试剂：ttx标准品(纯度≥99.0％，美国sigma公司)，乙酸、甲酸(分析纯，广州化学试剂厂)、乙腈、甲醇等(均为色谱纯，美国sigma公司)，氨水(分析纯，广州化学试剂厂)，乙酸、甲醇(均为色谱纯，美国sigma公司)，多壁碳纳米管cnt10350μm(北京德科岛科技有限公司)。2样品采集与制备织纹螺生物样品，采集自广东湛江。整体生物样品4℃冷藏运输回实验室，对冻织纹螺样品用纯水进行多次清洗，待洗去表面淤泥后，敲碎外壳，取所有的软组织，用均质仪进行均质处理。所制备的样品使用前于-20℃冷冻保存。3仪器测定条件3.1uplc-ms/ms测定条件3.1.1液相色谱条件色谱柱：watersacquityuplc@behamide(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：乙腈(a)和0.1％甲酸溶液(b)；梯度洗脱程序：0～1.0min，5％～60％b；1.0～3.0min，60％b；3.0～3.2min，60％～5％b；3.2～5.0min，5％b。柱温：40℃；进样量：10μl；流速：0.30ml/min。3.1.2质谱条件离子源：电喷雾电离(esi)；监测方式：多反应监测(mrm)；扫描方式：正离子扫描；离子源温度：150℃；毛细管电压：3.0kv；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流量：900l/hr；碰撞气流速：0.2ml/min；锥孔反吹气流量：150l/hr。ttx的母离子、子离子及具体质谱参数见表1。表1ttx质谱采集mrm参数化合物电离模式母离子/(m/z)子离子/(m/z)锥孔电压/(v)碰撞能量(ev)ttxesi+320.1302.0*，161.93520，35注：表1中带*为定量离子。3.2制备液相测定条件色谱柱：inertsustainamide制备柱(20mm×250mm，5μm)；进样量：5ml；流速：6.00ml/min；柱温：35℃，紫外检测波长200nm。流动相a为乙腈，流动相b为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱程序：0～10min，10％～80％b；10.0～12.5min，80％b；12.5～16.0min，80％～10％b；16.0～25.0min，10％b。4样品提取、净化与制备纯化步骤(1)织纹螺样品的提取：准确称取经充分匀质的样品200g，于2l烧杯中，加入1l1％乙酸甲醇溶液，60℃超声水浴超声提取15min，移取上清液，在残渣中加入1l1％乙酸甲醇溶液，重复提取1次，合并2次的提取液，定容至2l。(2)碳纳米管固相萃取小柱净化：称取mwcnts粉末，于单口烧瓶中，加入100ml浓h2so4、200ml浓hno3，超声振荡1h，静置后除去上层溶液，反复用蒸馏水洗至中性，80℃干燥后研磨。称取5g酸化处理的多壁碳纳米管，用甲醇作为分散剂，湿法装填于空的30ml小柱中，依次加入10ml0.1％乙酸-乙腈水溶液(8∶2，v/v)、10ml0.1％氨水活化和平衡小柱，挤干柱中残留液体。移取步骤(1)粗提取毒液200ml，在样液中逐滴加入氨水并充分搅拌，调节ph为8.5，通过碳纳米管小柱净化。上样完成，挤干柱中液体后，用30ml甲醇、30ml纯水依次淋洗，挤干小柱，用50ml0.1％乙酸-乙腈水溶液(8∶2，v/v)洗脱。收集洗脱液，供纯化制备步骤用。(3)制备液相纯化：步骤(2)收集的净化毒液，60℃水浴旋蒸浓缩至体积不变，除去乙腈溶剂。步骤(3)浓缩的毒液上按照3.2制备hplc条件进样纯化，根据标准溶液ttx出峰时间，确定样品中目标毒素组分采集时间，收集该段时间内的流出液。流出液旋转蒸发浓缩，用氨水调节ph8.5～9.0，进行冷冻干燥处理，-81℃冷冻干燥至析出纯品结晶。制备的标准生物样品用0.1％甲酸-乙腈水溶液(1∶1，v/v)溶解并定容，稀释到合适的浓度，uplc-ms/ms进行纯度测定分析。5工艺优化研究(1)提取工艺：对ttx样品的提取溶剂种类、水浴温度、液料比因素进行实验分析，同时通过水浴结合超声辅助提取和传统水浴提取方法进行试验比较。如附图2所示，纯甲醇溶液对织纹螺中ttx的提取效果较差，而乙酸水溶液与乙酸甲醇溶液对ttx的提取效率差异不明显。乙酸甲醇溶液作为提取溶剂对生物组织样品的穿透能力强，使样品中的蛋白质发生沉降，而使用乙酸水提取时会将样品中的部分水溶性蛋白质和杂质提取出来，且后续净化操作时小柱堵塞严重，因此选用乙酸甲醇溶液作为提取溶液。试验比较了不同乙酸体积比下乙酸甲醇溶液的提取效果，提取结果如附图3所示。当提取液中的乙酸的体积分数为0.5％～1％时，随着乙酸比例的升高，样品提取液中ttx的浓度不断提高；当提取液中的乙酸的体积分数大于2～5％时，提取效率没有出现明显上升。因此选用浓度为1％乙酸甲醇溶液提取织纹螺，便于后续净化操作。采用水浴结合超声辅助法提取与传统水浴加热方法相比，超声水浴法提取率提高了22.4％。当液料比为1∶1，2∶1，3∶1，4∶1时，均不能充分提取织纹螺样品中的ttx。当液料比5∶1与6∶1时，能有效提取样品中的ttx。考虑2种液料比下的提取效率相当，为减少不必要的试剂浪费，选用5∶1液料比提取织纹螺样品中ttx。提高水浴加热温度，可以增加提取效率，但是过高的提取温度不仅会增加能源消耗，也容易使样品中的其他成分析出，给后续样品净化工作带来难度。在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下样品中ttx的提取液浓度如附图4所示。随着水浴温度发生变化，样品中的ttx提取率发生改变，提取液中的ttx浓度与水浴温度存在正相关。水浴温度为20℃～60℃时，提取液中ttx的浓度从1.50μg/ml提高到3.10μg/ml。水浴温度升至70℃时，提取液的浓度出现下降，可能是随着水浴温度的不断升高，样品中的其他共萃取成分增加，导致提取液中ttx的提取效率下降。因此确定60℃作为水浴提取温度。确定最佳的织纹螺肉中ttx提取条件：以1％乙酸水溶液为提取剂，以60℃作为水浴温度，确定料液比为5∶1，分2次提取，通过水浴结合超声辅助提取样品中的ttx。(2)净化工艺：多壁碳纳米管用混酸(硝酸和硫酸)进行处理，在表面接枝上羟基、羧基等含氧极性基团，增加碳纳米管的活性除去杂质。酸化处理后的多壁碳纳米管吸附力强，对样品的净化效果好。在选择装填小柱规格时，选用6ml空小柱装填，装填后碳纳米管填料柱床会有空隙出现，使得吸附效果减弱，且吸附容量有限，净化过程容易漏穿，因此选用30ml的spe空柱进行湿法装填。ttx与碳纳米管填料的结合作用力与提取样液的ph有关，酸性或中性ph范围内结合保留能力较弱，需要用氨水调节样液的酸碱度至碱性条件下，能跟碳纳米管填料稳定保留结合。通过比较不同ph条件下提取液的回收率，优化上样液的ph值，见附图5。提取样液在ph8.5～9.0之间上样时，填料的吸附结合能力最强，当ph≥9.0时，ttx不稳定，易结构异化或者分解，造成提取液中ttx回收率下降，因此确定提取样液的ph为8.5～9.0来净化。试验比较了不同配比2％乙酸乙腈水溶液洗脱液对ttx洗脱效果的影响。其中2％乙酸乙腈溶液和2％乙酸-乙腈水溶液(20∶80，v/v)洗脱效果很差，几乎不能将吸附的ttx洗脱下来；2％乙酸-乙腈水溶液(40∶60，v/v)和2％乙酸-乙腈水溶液(60∶40，v/v)洗脱液虽然洗脱峰提前，在3～4bv出现峰值，但是洗脱液中的ttx总含量过低。综合考虑，洗脱溶液选用2％乙酸-乙腈水溶液(80∶20)，洗脱剂量10bv较为合适。洗脱时，用50ml0.1％乙酸-乙腈水溶液(8∶2，v/v)即可将ttx完全洗脱下来。不同配比洗脱液的解吸效果比较图可见附图6。(3)制备纯化工艺：将配制好的10μg/mlttx标准溶液经制备hplc分析，液相色谱图如附图7所示。ttx出峰时间为8.996min，目标物从8.20min开始出峰，在约1.5min内结束出峰，因此确定以8.40～10.40min为目标毒素组分采集时间，收集该段时间内的流出液。用watersfractioncollector设置采集参数，对流出液进行采集，共得到540ml纯化液。将收集得到的540ml流出液经过旋转蒸发浓缩至体积恒定(除去乙腈溶剂)，用氨水调节ph8.5～9.0，进行冷冻干燥处理，得到纯品。纯品为白色晶体，无臭，可溶解于酸性溶液中。准确称取1.00mg制备得到的纯品，用0.1％甲酸-乙腈水溶液(1∶1，v/v)溶解并定容至10ml，稀释到合适的浓度，进行uplc-ms/ms分析，制备的标准产品的纯度＞99.0％。当前第1页12