本发明涉及的是一种分子印迹传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种扑草净分子印迹传感器的制备方法，用于检测样品中的扑草净。
背景技术
除草剂在世界农业生产中发挥着重要的作用，然而在其大大节约劳动力、提高作物经济产出而被大量使用的同时，由于相对较高的溶解度和残留时间，使得除草剂在经地表或地下径流后，进入水生系统，因而常在世界各除草剂使用国的水生系统中被检出，威胁水生生物生存与水生环境的健康。随着农药等化学品在农业生产上的广泛应用，它们所带来的生态与环境问题日益严重，影响范围已由陆地扩大至海洋。阿特拉津和扑草净通过阻断电子从质醌qa向qb的传递，从而使植物光和作用受阻。1μg/l的扑草净即引起了矮大叶藻、孔石莼和海索面显著的光合抑制，抑制率约7.54%-12.94%，在相同浓度下,扑草净的毒性作用大于阿特拉津，表明其环境毒性更强。我国近年来扑草净使用量不断增大，尤其是在沿海海域更为明显，因此其带来的生态风险需引起重视。并在环境中不断被检出，对浅海环境的影响亦需要准确评估。扑草净对浅海水生植物的光合抑制作用进行了研究，除室内短期模拟实验外，野外长期跟踪监测有待开展，同时在生理和代谢水平上的毒性影响亦需要深入开展。
目前，检测扑草净的方法主要有高效液相色谱、液相色谱-质谱，这些方法的准确度受到一定限制、而且仪器比较贵需要专业人员操作，检测周期长，也限制了其应用。另外，由于扑草净在蔬菜等植物上残留量比较低、共存物质互相干扰，准确检测扑草净很困难。因此，找到一种选择性好、灵敏度高、操作简便用于的检测扑草净的方法具有重要使用价值。
分子印迹技术是当前开发具有分子识别功能的高选择性材料的主要方法之一，它是通过在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在分子印迹聚合物的网络结构中留下具有结合能力的识别位点，对模板分子表现出高选择识别性能的一种技术。这项技术以其构效预定性和特异识别性越来越受到人们的关注，已经成功用于固相萃取或微固相萃取，亲和色谱或毛细管电泳及传感器等领域。
依据此技术制备的分子印迹传感器，应用于药物分析、环境保护及生命科学研究中起着十分重要的作用。将功能分子以适当方式修饰到电极上，制备选择性好、灵敏度高、有一定使用寿命可再生的电化学传感器成为分析科学工作者努力探索的课题。但是传统的印迹方法所制备的印迹膜厚度难以控制，高交联度使得电子传递速度和响应慢、检测下限高，影响分子印迹技术在电化学传感器中的应用。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对食品、药品、生物样品中的扑草净含量准确定量测定十分必要。
本发明的目的是将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种扑草净分子印迹传感器的制备方法，主要是以n-烯丙基-2-氨甲基吡咯烷和4-氨基吡啶为功能单体，二异氰酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，扑草净为模板，在玻碳电极表面通过氧化石墨烯、纳米银粒子的修饰，提高了传感器的灵敏度，采用滴涂法构建扑草净分子印迹电化学传感器。
技术实现要素：
仪器与试剂
chi660b电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，ag/agcl为参比电极（sce），玻碳电极（gce）为工作电极；kq-250e型超声波清洗器（坤峰超声仪器有限公司）。
氧化石墨烯；n-烯丙基-2-氨甲基吡咯烷，4-氨基吡啶，二异氰酸酯，偶氮二异丁腈，扑草净，甲醇，乙醇，硝酸银，壳聚糖，醋酸，葡萄糖，氨水，磷酸缓冲溶液；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
一种扑草净分子印迹传感器的制备方法，特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）纳米银/氧化石墨烯修饰液制备：在反应器中，按如下组成质量比加入，质量百分浓度为5%的氨水溶液：85~92%，硝酸银：1.0~3.0%，氧化石墨烯：2~6%，室温下超声30min，分散均匀，再加入葡萄糖：2~7%，各组分含量之和为百分之百，室温，搅拌反应20min，得到纳米银/氧化石墨烯修饰液；
（2）纳米银/氧化石墨烯修饰电极制备：将玻碳电极依次用0.3μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后分别用二次蒸馏水超声清洗，乙醇洗涤，吹干，将15~18μl纳米银/氧化石墨烯修饰液滴涂在玻碳电极表面，取出置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米银/氧化石墨烯修饰电极；
（3）扑草净分子印迹聚合物的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，乙醇：76~82%，n-烯丙基-2-氨甲基吡咯烷：8~12%，4-氨基吡啶：4~8%，扑草净：2~5%，二异氰酸酯：0.5~1.5%，偶氮二异丁腈：0.5~1.5%，各组分含量之和为百分之百，搅拌溶解，通氮气除氧15min，无氧氛围，55±2℃搅拌反应10~12h，将得到的产物用乙醇：乙酸体积比为8:1混合溶液浸泡8h，多次洗涤，除去模板分子，干燥，即得扑草净分子印迹聚合物；
（4）扑草净分子印迹传感器的制备：取适量的扑草净分子印迹聚合物分散于1%的壳聚糖乙酸溶液中，制得20g/l的扑草净分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15~18μl滴加到步骤（2）制备的纳米银/氧化石墨烯修饰电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得扑草净分子印迹传感器。
在步骤（1）中所述的硝酸银与氧化石墨烯的质量比为1：2~2.2之间。
在步骤（1）中所述的硝酸银与葡萄糖的质量比为1：2.5~3.0之间。
在步骤（3）中所述的n-烯丙基-2-氨甲基吡咯烷与4-氨基吡啶的摩尔为1：1。
在步骤（3）中所述的无氧氛围为聚合反应过程一直通入氮气体。
本发明的优点及效果是：
本发明将印迹技术、层层自组装法和滴涂法相结合，在纳米银/氧化石墨烯修饰玻碳电极表面成功地研制了一种具有特异选择性的扑草净印迹电化学传感器，通过与未采用纳米银/氧化石墨烯修饰的分子印迹电极的响应进行比较，本发明制备的扑草净分子印迹传感器的响应大大提高，选择性好，灵敏度高。该印迹传感器对扑草净表现出较高的亲和性和选择性，响应电流与扑草净的浓度在6.0×10-8~5.0×10-6mol/l范围内呈良好的线性关系，检测限为1.78×10-9mol/l将本发明制备的扑草净分子印迹电化学传感器成功用于样品中扑草净的检测中，回收率在95.92~103.49%之间，因此本发明制备的扑草净分子印迹传感器可广泛应用于化工、农药残留、生物、环保检测等相关领域。
具体实施方式
实施例1
（1）纳米银/氧化石墨烯修饰液制备：在反应器中，分别加入，质量百分浓度为5%的氨水溶液：88ml，硝酸银：2.0g，氧化石墨烯：4.0g，室温下超声30min，分散均匀，再加入葡萄糖：6.0g，室温，搅拌反应20min，得到纳米银/氧化石墨烯修饰液；
（2）纳米银/氧化石墨烯修饰电极制备：将玻碳电极依次用0.3μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后分别用二次蒸馏水超声清洗，乙醇洗涤，吹干，将17μl纳米银/氧化石墨烯修饰液滴涂在玻碳电极表面，取出置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米银/氧化石墨烯修饰电极；
（3）扑草净分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：100ml，n-烯丙基-2-氨甲基吡咯烷：10g，4-氨基吡啶：6.0g，扑草净：3.0g，二异氰酸酯：1.0g，偶氮二异丁腈：1.0g，搅拌溶解，通氮气除氧15min，无氧氛围，55±2℃搅拌反应11h，将得到的产物用乙醇：乙酸体积比为8:1混合溶液浸泡8h，多次洗涤，除去模板分子，干燥，即得扑草净分子印迹聚合物；
（4）扑草净分子印迹传感器的制备：取适量的扑草净分子印迹聚合物分散于1%的壳聚糖乙酸溶液中，制得20g/l的扑草净分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液16μl滴加到步骤（2）制备的纳米银/氧化石墨烯修饰电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得扑草净分子印迹传感器。
实施例2
（1）纳米银/氧化石墨烯修饰液制备：在反应器中，分别加入，质量百分浓度为5%的氨水溶液：92ml，硝酸银：1.0g，氧化石墨烯：2.0g，室温下超声30min，分散均匀，再加入葡萄糖：5.0g，室温，搅拌反应20min，得到纳米银/氧化石墨烯修饰液；
（2）纳米银/氧化石墨烯修饰电极制备：将玻碳电极依次用0.3μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后分别用二次蒸馏水超声清洗，乙醇洗涤，吹干，将16μl纳米银/氧化石墨烯修饰液滴涂在玻碳电极表面，取出置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米银/氧化石墨烯修饰电极；
（3）扑草净分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：104ml，n-烯丙基-2-氨甲基吡咯烷：8.0g，4-氨基吡啶：5.0g，扑草净：2.0g，二异氰酸酯：1.5g，偶氮二异丁腈：150g，搅拌溶解，通氮气除氧15min，无氧氛围，55±2℃搅拌反应10h，将得到的产物用乙醇：乙酸体积比为8:1混合溶液浸泡8h，多次洗涤，除去模板分子，干燥，即得扑草净分子印迹聚合物；
（4）扑草净分子印迹传感器的制备：取适量的扑草净分子印迹聚合物分散于1%的壳聚糖乙酸溶液中，制得20g/l的扑草净分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液17μl滴加到步骤（2）制备的纳米银/氧化石墨烯修饰电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得扑草净分子印迹传感器。
实施例3
（1）纳米银/氧化石墨烯修饰液制备：在反应器中，分别加入，质量百分浓度为5%的氨水溶液：85ml，硝酸银：3.0g，氧化石墨烯：5.0g，室温下超声30min，分散均匀，再加入葡萄糖：7.0g，室温，搅拌反应20min，得到纳米银/氧化石墨烯修饰液；
（2）纳米银/氧化石墨烯修饰电极制备：将玻碳电极依次用0.3μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后分别用二次蒸馏水超声清洗，乙醇洗涤，吹干，将15μl纳米银/氧化石墨烯修饰液滴涂在玻碳电极表面，取出置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米银/氧化石墨烯修饰电极；
（3）扑草净分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：96ml，n-烯丙基-2-氨甲基吡咯烷：12g，4-氨基吡啶：7.0g，扑草净：4.0g，二异氰酸酯：0.5g，偶氮二异丁腈：0.5g，搅拌溶解，通氮气除氧15min，无氧氛围，55±2℃搅拌反应12h，将得到的产物用乙醇：乙酸体积比为8:1混合溶液浸泡8h，多次洗涤，除去模板分子，干燥，即得扑草净分子印迹聚合物；
（4）扑草净分子印迹传感器的制备：取适量的扑草净分子印迹聚合物分散于1%的壳聚糖乙酸溶液中，制得20g/l的扑草净分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15μl滴加到步骤（2）制备的纳米银/氧化石墨烯修饰电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得扑草净分子印迹传感器。
实施例4
（1）纳米银/氧化石墨烯修饰液制备：在反应器中，分别加入，质量百分浓度为5%的氨水溶液：90ml，硝酸银：1.5g，氧化石墨烯：6.0g，室温下超声30min，分散均匀，再加入葡萄糖：2.5g，室温，搅拌反应20min，得到纳米银/氧化石墨烯修饰液；
（2）纳米银/氧化石墨烯修饰电极制备：将玻碳电极依次用0.3μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后分别用二次蒸馏水超声清洗，乙醇洗涤，吹干，将18μl纳米银/氧化石墨烯修饰液滴涂在玻碳电极表面，取出置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米银/氧化石墨烯修饰电极；
（3）扑草净分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：97ml，n-烯丙基-2-氨甲基吡咯烷：9g，4-氨基吡啶：8.0g，扑草净：5.0g，二异氰酸酯：0.8g，偶氮二异丁腈：0.8g，搅拌溶解，通氮气除氧15min，无氧氛围，55±2℃搅拌反应10.5h，将得到的产物用乙醇：乙酸体积比为8:1混合溶液浸泡8h，多次洗涤，除去模板分子，干燥，即得扑草净分子印迹聚合物；
（4）扑草净分子印迹传感器的制备：取适量的扑草净分子印迹聚合物分散于1%的壳聚糖乙酸溶液中，制得20g/l的扑草净分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液18μl滴加到步骤（2）制备的纳米银/氧化石墨烯修饰电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得扑草净分子印迹传感器。
实施例5
将上述实施例1~4所制备的扑草净分子印迹传感器，用于扑草净的检测，步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的扑草净标准溶液，底液为ph6.5的磷酸盐缓冲溶液；
（2）工作曲线绘制：将ag/agcl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的扑草净分子印迹传感器为工作电极组成三电极系统，连接chi660b电化学工作站，在k3[fe(cn)6]溶液中，采用循环伏安法在-0.30~0.8v电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为i0，含有不同浓度的扑草净标准溶液的响应电流即为ii，响应电流降低的差值为△i=i0-ii，△i与扑草净标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制△i~c工作曲线；
（3）扑草净的检测：用待测样品代替步骤（1）中的扑草净标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△i和工作曲线，得到待测样品中扑草净的含量；
所述k3[fe(cn)6]溶液的浓度为5.0mmol/l；
所述ph6.5的磷酸盐缓冲溶液的浓度在50mmol/l。