一种电化学免疫传感器及其制备方法和其应用与流程

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种电化学免疫传感器及其制备方法和其应用。

背景技术：

新城疫(newcastledisease，nd)是由新城疫病毒(ndv)引起的一种急性、热性、败血性和高触性禽类传染病，其发病率与死亡率都很高，严重危害着我国养禽业的发展。近几年，新城疫的发病情况和流行态势日益复杂，新城疫病毒强弱毒株混合感染在禽群中越来越常见，区分新城疫病毒强弱毒株在新城疫诊断与防控上也越来越受到重视。

目前检测ndv的主要方法有病毒分离鉴定、血凝-血凝抑制试验(ha-hi试验)、反转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)和实时荧光定量pcr等。但这些方法各有不足之处,如病毒分离鉴定及ha-hi试验所耗时较长，不适应临床快速诊断的要求，rt-pcr技术复杂且电泳时需要接触eb等有害物质，实时荧光定量pcr所需仪器和试剂昂贵，这些不足阻碍了它们的在临床诊断上的应用。

技术实现要素：

本发明公开了一种电化学免疫传感器及其制备方法和其应用。本发明选用甲壳胺修饰石墨烯，制成石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物(g-chi-aunps纳米复合物)和石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物(g-chi-cunps纳米复合物)，进一步建立了一种简便、快速、灵敏的电化学免疫传感器和检测技术，可实现痕量病毒的简便快速分析检测。

本发明的一个目的是提供一种传感器，包括石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物，所述传感器还包括石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物。

具体的，所述传感器还包括下述1)-10)所述中的至少一种：

1)所述石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物的制备方法包括：利用甲壳胺修饰石墨烯并负载铜纳米粒子后即得；

具体的，所述石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物的制备方法包括：将甲壳胺加入到醋酸溶液中，室温下搅拌，再加入石墨烯超声，再加入cuso4溶液，在室温条件下搅拌，然后水浴加热至95℃继续反应0.5h即得；

再具体的，所述石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物的制备方法包括：将每0.1g的甲壳胺加入到每100ml体积分数为1.0％的醋酸水溶液中，室温下条件下磁力搅拌1h，得到0.1wt％甲壳胺溶液，将每2.5mg的石墨烯加入到每25ml以上的甲壳胺溶液中超声1h，室温条件下搅拌24h,得到g-chi悬浊液；将每20ml10mmcuso4水溶液加入到每25ml以上的g-chi悬浊液中，在室温条件下搅拌3h，然后水浴加热至95℃继续反应0.5h，待其冷却至室温后用二次去离子水反复离心洗涤3次，即得；

2)所述石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物的制备方法包括：利用甲壳胺修饰石墨烯并负载金纳米粒子后即得；

具体的，所述石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物的制备方法包括：将甲壳胺加入到醋酸溶液中，室温下搅拌，再加入石墨烯超声、室温条件下搅拌，再加入haucl4溶液，在室温条件下搅拌，然后水浴加热至80℃继续反应1h即得；

再具体的，所述石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物的制备方法包括：将每0.1g的甲壳胺加入到每100ml体积分数为1.0％的醋酸水溶液中，室温条件下磁力搅拌1h，得到0.1wt％甲壳胺溶液，将每1mg的石墨烯加入到每1ml以上的甲壳胺溶液中超声2h，得到g-chi悬浊液；将每1ml质量分数为1.0％的haucl4水溶液加入到每1ml以上的g-chi悬浊液中，在室温条件下搅拌30min，然后水浴加热至80℃继续反应1h即得；

3)单克隆抗体；

具体的，所述单克隆抗体包括与待测物质特异性结合的单克隆抗体；

再具体为抗ndv单克隆抗体；

还具体为圣克鲁斯生物技术的ndvhn抗体(11f12)；

4)bsa；

5)玻碳电极和/或金电极；

6)对电极；具体为铂丝电极；

7)参比电极；具体为饱和甘汞电极；

8)多克隆抗体；

具体的，所述多克隆抗体包括与待测物质特异性结合的多克隆抗体；再具体为抗ndv多克隆抗体；

还具体为abcam的anti-newcastlediseasevirusantibody(ab34402)；

9)石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物和多克隆抗体的反应产物；

10)当所述传感器包括石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物、玻碳电极、单克隆抗体时，所述石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物位于玻碳电极和单克隆抗体之间。

和/或具体的，所述传感器的制备方法包括：

将石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物涂到玻碳电极和/或金电极表面，晾干，然后涂单克隆抗体，反应后再用bsa溶液封闭，封闭完后清洗；具体的，将每10μl石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物涂到玻碳电极表面，4℃下自然晾干，然后涂10μl10μg/ml单克隆抗体，置于4℃下反应8小时，再浸泡200μl1wt％bsa溶液37℃下封闭1h，取出用二次去离子水洗净；和/或具体的，所述单克隆抗体包括与待测物质特异性结合的单克隆抗体；再具体为抗ndv单克隆抗体；还具体为圣克鲁斯生物技术的ndvhn抗体(11f12)；

将石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物、多克隆抗体和bsa反应；具体的，每1ml石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物中，加入50μl的多克隆抗体、200μl的1wt％bsa溶液，4℃-37℃反应40min以上即得；再具体的，4℃反应过夜或37℃反应40min以上；和/或再具体的，反应完后还包括用二次去离子水离心洗涤；所述离心包括10000r/min,10min；和/或所述离心洗涤包括离心洗涤3次；和/或具体的，所述多克隆抗体包括与待测物质特异性结合的多克隆抗体；再具体为抗ndv多克隆抗体；还具体为abcam的anti-newcastlediseasevirusantibody(ab34402)。

本发明的另一个目的是提供一种复合物，所述复合物包括：石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物和多克隆抗体的反应产物。

具体的，所述复合物还包括下述1)-2)所述中的至少一种：

1)所述石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物的制备方法包括：利用甲壳胺修饰石墨烯并负载铜纳米粒子后即得；

具体的，所述石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物的制备方法包括：将甲壳胺加入到醋酸溶液中，室温下搅拌，再加入石墨烯超声，再加入cuso4溶液，在室温条件下搅拌，然后水浴加热至95℃继续反应0.5h即得；

再具体的，所述石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物的制备方法包括：将每0.1g的甲壳胺加入到每100ml体积分数为1.0％的醋酸水溶液中，室温下条件下磁力搅拌1h，得到0.1wt％甲壳胺溶液，将每2.5mg的石墨烯加入到每25ml以上的甲壳胺溶液中超声1h，室温条件下搅拌24h,得到g-chi悬浊液；将每20ml10mmcuso4水溶液加入到每25ml以上的g-chi悬浊液中，在室温条件下搅拌3h，然后水浴加热至95℃继续反应0.5h，待其冷却至室温后用二次去离子水反复离心洗涤3次，即得；

2)所述反应产物的制备方法包括：将石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物、多克隆抗体和bsa反应；

具体的，每1ml石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物中，加入50μl的多克隆抗体、200μl的1wt％bsa溶液，4℃-37℃反应40min以上即得；再具体的，4℃反应过夜或37℃反应40min以上；和/或再具体的，反应完后还包括用二次去离子水离心洗涤；所述离心包括10000r/min,10min；和/或所述离心洗涤包括离心洗涤3次；

和/或具体的，所述多克隆抗体包括与待测物质特异性结合的多克隆抗体；再具体为抗ndv多克隆抗体；还具体为abcam的anti-newcastlediseasevirusantibody(ab34402)。

本发明的再一个目的是提供一种传感器的制备方法，所述方法包括：

将石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物涂到玻碳电极和/或金电极表面，晾干，然后涂单克隆抗体，反应后再用bsa溶液封闭，封闭完后清洗；具体的，将每10μl石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物涂到玻碳电极表面，4℃下自然晾干，然后涂10μl10μg/ml单克隆抗体，置于4℃下反应8小时，再浸泡200μl1wt％bsa溶液37℃下封闭1h，取出用二次去离子水洗净；和/或具体的，所述单克隆抗体包括与待测物质特异性结合的单克隆抗体；再具体为抗ndv单克隆抗体；还具体为圣克鲁斯生物技术的ndvhn抗体(11f12)；

将石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物、多克隆抗体和bsa反应。具体的，每1ml石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物中，加入50μl的多克隆抗体、200μl的1wt％bsa溶液，4℃-37℃反应40min以上即得；再具体的，4℃反应过夜或37℃反应40min以上；和/或再具体的，反应完后还包括用二次去离子水离心洗涤；所述离心包括10000r/min,10min；和/或所述离心洗涤包括离心洗涤3次；和/或具体的，所述多克隆抗体包括与待测物质特异性结合的多克隆抗体；再具体为抗ndv多克隆抗体；还具体为abcam的anti-newcastlediseasevirusantibody(ab34402)。

本发明的还一个目的是提供一种复合物的制备方法，所述方法包括：将石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物、多克隆抗体和bsa反应。

具体的，每1ml石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物中，加入50μl的多克隆抗体、200μl的1wt％bsa溶液，4℃-37℃反应40min以上即得；再具体的，4℃反应过夜或37℃反应40min以上；和/或再具体的，反应完后还包括用二次去离子水离心洗涤；所述离心包括10000r/min,10min；和/或所述离心洗涤包括离心洗涤3次；

和/或具体的，所述石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物的制备方法包括：利用甲壳胺修饰石墨烯并负载铜纳米粒子后即得；再具体的，将甲壳胺加入到醋酸溶液中，室温下搅拌，再加入石墨烯超声，再加入cuso4溶液，在室温条件下搅拌，然后水浴加热至95℃继续反应0.5h即得；还具体的，所述石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物的制备方法包括：将每0.1g的甲壳胺加入到每100ml体积分数为1.0％的醋酸水溶液中，室温下条件下磁力搅拌1h，得到0.1wt％甲壳胺溶液，将每2.5mg的石墨烯加入到每25ml以上的甲壳胺溶液中超声1h，室温条件下搅拌24h,得到g-chi悬浊液；将每20ml10mmcuso4水溶液加入到每25ml以上的g-chi悬浊液中，在室温条件下搅拌3h，然后水浴加热至95℃继续反应0.5h，待其冷却至室温后用二次去离子水反复离心洗涤3次，即得；

和/或具体的，所述多克隆抗体包括与待测物质特异性结合的多克隆抗体；再具体为抗ndv多克隆抗体；还具体为abcam的anti-newcastlediseasevirusantibody(ab34402)。

本发明的还一个目的是提供一种检测方法，所述方法包括下述1)-4)所述中的至少一种：

1)使用本发明任一所述的传感器进行检测；

2)使用本发明任一所述的复合物进行检测；

3)使用本发明任一所述方法直接制备得到的传感器进行检测；

4)使用本发明任一所述方法直接制备得到的复合物进行检测。

具体的，所述检测方法还包括：

将石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物涂到玻碳电极和/或金电极表面，晾干，然后涂单克隆抗体，反应后再用bsa溶液封闭，封闭完后清洗；再涂待测样品，37℃下反应30min以上，最后涂本发明任一所述的复合物,或本发明任一所述方法直接制备得到的复合物，然后于37℃反应40min以上，最后进行峰电流值的检测。

再具体的，所述检测方法还包括：

将每10μl石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物涂到玻碳电极表面，4℃下自然晾干，然后涂10μl10μg/ml单克隆抗体，置于4℃下反应8小时，再浸泡200μl1wt％bsa溶液37℃下封闭1h，取出用二次去离子水洗净；再滴涂15μl待测样品37℃下反应30min，最后滴涂15μl本发明任一所述的复合物,或本发明任一所述方法直接制备得到的复合物，置于密闭湿润盒内,然后于37℃温箱内反应40min，用二次去离子水反复洗涤3次，最后进行峰电流值的检测。

所述峰电流值的检测包括：在含0.1mol·l^-1kcl，ph＝7.0的0.01mol·l^-1pbs溶液中进行差分脉冲伏安测试，电化学工作站的dvp测定参数包括：电位扫描范围-0.3～0.4v，扫描速率为0.05v/s；对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极。

和/或再具体的，所述单克隆抗体包括与待测物质特异性结合的单克隆抗体；再具体为抗ndv单克隆抗体；还具体为圣克鲁斯生物技术的ndvhn抗体(11f12)；

本发明的最后一个目的是提供本发明任一所述的传感器、本发明任一所述的复合物、本发明任一所述方法直接制备得到的传感器、本发明任一所述方法直接制备得到的复合物、本发明任一所述方法的应用。

具体的，所述引用包括在检测和/或在制备用于检测的产品中的应用。

再具体的，所述引用包括在检测新城疫病毒ndv和/或在制备用于检测新城疫病毒ndv的产品中的应用。

所述应用不包括以疾病的诊断和治疗为目的应用。

本发明的有益效果包括：

本发明选用甲壳胺修饰石墨烯，制成石墨烯-甲壳胺-金纳米粒子纳米复合物(g-chi-aunps纳米复合物)和石墨烯-甲壳胺-铜纳米粒子纳米复合物(g-chi-cunps纳米复合物)，进一步建立了一种简便、快速、灵敏的电化学免疫传感器和检测技术。

本发明提供的电化学免疫传感器是将免疫检测技术与电化学传感技术相结合，构建而成的一种新型生物传感器。它同时具备了免疫测定法的高特异性和电化学传感技术的高敏感性，可用于痕量病毒的分析检测。

本发明首次提出并应用以g-chi-aunps作为传感器平台，以g-chi-cunps作为传感器的信号放大材料，建立了了一种特异、敏感和快速的新型检测诊断方法，对病毒的有效防控具有重要意义。

在一个具体的实施方式中，本发明提供的电化学免疫传感器可实现特异性检测ndv，且对ndv检测的敏感性可达10¹eid50/ml。

附图说明

图1描述免疫传感器制备过程的循环伏安图，其中a代表玻碳电极循环伏安曲线；b代表玻碳电极上覆盖了一层aunps-chi之后的循环伏安曲线；c代表g-chi-aunps纳米复合物修饰电极后的循环伏安曲线；d，e分别代表g-chi-aunps纳米复合物修饰电极表面固定了mab、bsa后的循环伏安曲线。

图2为免疫传感器检测过程的差分脉冲伏安图，其中a代表g-chi-aunps纳米复合物修饰电极表面依次固定了mab和bsa后的差分脉冲伏安曲线；b代表滴涂ndv并以chi-cunps-pab/ndv纳米复合物作为标记物后的差分脉冲伏安曲线；c代表滴涂ndv并以g-chi-cunps-pab/ndv纳米复合物作为标记物后的差分脉冲伏安曲线。

图3为条件优化实验中峰电流值和时间关系曲线图，其中a代表ndv和g-chi-cunps-pab/ndv纳米复合物的免疫反应时间优化曲线；b代表g-chi-cunps-pab/ndv纳米复合物的免疫反应时间优化曲线。

图4为特异性实验结果图，其中，1-8依次代表ⅰ群禽腺病毒(aav)、传染性支气管炎(ibv),传染性喉气管(iltv),h5亚型禽流感病毒(aivh5),h7亚型禽流感病毒(aivh7),禽呼肠孤病毒(arv),传染性法氏囊病毒(ibd)、新城疫病毒(ndv)的检测结果。

图5为敏感性实验结果图，其中，曲线a-g依次代表ndv浓度为0、100、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵时的检测结果。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，并结合附图说明对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的抗ndv单克隆抗体(mab/ndv)购自圣克鲁斯生物技术(santacruzbiotechnology)；产品名称：ndvhn抗体(11f12)或ndvhnantibody(11f12)；产品编号：sc-52112；是小鼠单克隆igg2a。

下述实施例中所用的抗ndv多克隆抗体(pab/ndv)购自abcam；产品名称：anti-newcastlediseasevirusantibody(ab34402)；产品目录号：ab34402；是鸡的多克隆抗体igy。

下述实施例中所用的试剂haucl4、cuso4及牛血清白蛋白(bsa)购自sigma公司；kmno4、k4fe(cn)6、k3fe(cn)6、h2so4、ch3ch2oh、甲壳胺、十二水合柠檬酸三钠等均为国产分析纯，实验用水为二次去离子水。

下述实施例中所用的毒株与菌株来源：ndv毒株f48e9株购自中国兽药监察所；传染性支气管炎(ibv),传染性喉气管(iltv),h5亚型禽流感病毒(aivh5),h7亚型禽流感病毒(aivh7),禽呼肠孤病毒(arv),传染性法氏囊病毒(ibdv),ⅰ群禽腺病毒(aav)由广西兽医研究所生物技术实验室保存

实施例1、石墨烯电化学免疫传感器的制备和ndv的检测

石墨烯的制备

根据hummer方法改进后制得氧化石墨烯，实验步骤如下：冰水浴条件下加入1g石墨粉、2.5gkno3、100mlh2so4，搅拌均匀后缓慢加入5g高锰酸钾，随后置于35℃水浴反应2h，加入100ml去离子水，于95℃继续反应1h，观察到混合物由棕褐色变成亮黄色，冷却至室温后加入300ml蒸馏水，并加入h2o2(质量分数为30％)中和未反应的高锰酸钾，然后用0.5mol/l的hcl洗涤，再用二次去离子水反复离心洗涤5次，真空干燥，既得氧化石墨。称取10mg氧化石墨置于烧杯中，加入100ml二次去离子水，超声1h，得到氧化石墨烯(go)。再以nabh4作还原剂，95℃的条件下进行还原得到石墨烯。

g-chi-aunps纳米复合物的制备

将0.1g的甲壳胺(mv:1.5×10⁵；dac:≥90.0％；)(chi)加入到100ml1.0％(v/v)醋酸溶液中，室温条件下磁力搅拌1h，得到0.1wt％甲壳胺溶液。将1mg的石墨烯(g)加入到1ml以上甲壳胺溶液超声2h，得到稳定的g-chi悬浊液。取1ml质量分数为1.0％的haucl4溶液加入到上述制备好的g-chi悬浊液中，在室温条件下搅拌30min，然后水浴加热至80℃继续反应1h，得到g-chi-aunps纳米复合物。

g-chi-cunps纳米复合物的制备

将0.1g的甲壳胺(mv:1.5×10⁵；dac:≥90.0％；)(chi)加入到100ml1.0％(v/v)醋酸溶液中，室温下条件下磁力搅拌1h，得到0.1wt％甲壳胺溶液。将2.5mg的石墨烯(g)加入到25ml以上甲壳胺溶液超声1h，室温条件下搅拌24h,得到稳定的g-chi悬浊液。取20ml10mmcuso4溶液加入到上述制备好的g-chi悬浊液中，在室温条件下搅拌3h，然后水浴加热至95℃继续反应0.5h，待其冷却至室温后用二次去离子水反复离心(10000r/min,10min)洗涤3次，得到g-chi-cunps纳米复合物。

如无特殊说明，本实施例中所述溶液中的溶剂均为水(请核实)。

g-chi-cunps-pab/ndv纳米复合物的制备

移取1mlg-chi-cunps纳米复合物，加入50μl的pab/ndv，200μl的1wt％bsa溶液，在4℃冰箱内反应过夜或37℃反应40min，用二次去离子水反复离心(10000r/min,10min)洗涤3次。

传感器的制备和ndv的检测过程

用0.05μm的al2o3抛光粉将玻碳电极(ge,)打磨至镜面后，用去离子水清洗，再分别用二次去离子水、无水乙醇、二次去离子水超声5min，用n2吹干。然后将电极置于0.5mol·l^-1h2so4溶液(扫描前通入n2除氧15min)中进行循环伏安扫描，扫描速度为50mv/s(电压范围为-0.3～+1.5v)，扫描直到循环伏安图稳定之后，取出用蒸馏水洗净，n2吹干待用。

用移液枪移取10μlg-chi-aunps纳米复合物涂到玻碳电极表面，4℃下自然晾干，然后滴涂10μl10μg/ml抗ndv单克隆抗体(mab/ndv)置于4℃下反应8小时，再浸泡200μl1wt％bsa溶液37℃下封闭1h，取出用二次去离子水洗净，再滴涂15μl待测样品37℃下反应30min，最后滴涂15μlg-chi-cunps-pab/ndv纳米复合物置于密闭湿润盒内,然后于37℃温箱内反应40min，用二次去离子水反复洗涤3次，0.01mol·l^-1pbs(含0.1mol·l^-1kcl，ph＝7.0)溶液中进行差分脉冲伏安测试(dvp)，电化学工作站的dvp测定参数：电位扫描范围-0.3～0.4v，扫描速率为0.05v/s。对电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极。

电极修饰过程的电化学表征

图1描述免疫传感器制备过程的循环伏安图。图1中，曲线a为玻碳电极在含有5mmfe(cn)6^3-/4-和0.1mkcl的0.01mol/lpbs(ph7.0)缓冲溶液中的循环伏安曲线，该曲线出现氧化还原特征峰；曲线b是玻碳电极上覆盖了一层aunps-chi之后的循环伏安曲线，该曲线氧化还原峰电流值增加，其增加部分是因为金纳米粒子修饰有效的提高了电极表面的电子传导能力；曲线c是g-chi-aunps纳米复合物修饰电极后的循环伏安曲线，该曲线扫描响应电流值继续增加，是因为石墨烯具有大的比表面积和好的导电能力，因此石墨烯的加入有进一步提高了电极表面的电子传导能力；曲线d，e分别是g-chi-aunps纳米复合物修饰电极表面固定了mab、bsa后的循环伏安曲线，其氧化还原峰电流值下降，其明显下降说明部分蛋白分子物质阻碍了电极表面的电子转移通道。

图2为免疫传感器检测过程的差分脉冲伏安图。图2中,曲线a为g-chi-aunps纳米复合物修饰电极表面依次固定了mab和bsa后的在0.01mol·l^-1pbs(含0.1mol·l^-1kcl，ph＝7.0)溶液中进行差分脉冲伏安扫描的循环伏安曲线；当传感器滴涂15μl的ndv(f48e9,10⁵eid50)，并以chi-cunps-pab/ndv纳米复合物作为标记物时，其差分脉冲伏安曲线出现电化学吸收峰，如图2中的曲线b所示；当传感器同样滴涂15μl的ndv(f48e9,10⁵eid50)，以g-chi-cunps-pab/ndv纳米复合物作为标记物时，如图2中的曲线c所示，其差分脉冲伏安曲线出现的电化学吸收峰相对于曲线b明显增高，这是因为g具有大的比表面积，使得更多的cunps被固定到电极表面，且g具有较强的导电能力，加速了电极表面的电子转移。

条件优化

在传感器的检测过程中，样品ndv和g-chi-cunps-pab/ndv纳米复合物的免疫反应时间对传感器的响应信号有重要的影响。当电极滴涂了ndv后在37℃条件下依次反应5,10,15，20,30,40,50,60min，然后滴涂了g-chi-cunps-pab/ndv纳米复合物后在37℃条件下60min，在0.01mol·l^-1pbs(含0.1mol·l^-1kcl，ph＝7.0)溶液中进行差分脉冲伏安扫描。由此得到的峰电流值和时间关系曲线如图3中的曲线a所示，时间在30min内免疫电极的响应电流随着时间的延长而不断的增加，超出30min之后响应电流基本不变。此结果表明免疫反应需要时间是30min。对g-chi-cunps-pab/ndv纳米复合物的免疫反应时间进行优化，g-chi-cunps-pab/ndv纳米复合物在37℃条件下依次反应5,10,15，20,30,40,50,60min，然后在0.01mol·l^-1pbs(含0.1mol·l^-1kcl，ph＝7.0)溶液中进行差分脉冲伏安扫描。由此得到的峰电流值和时间关系曲线如图3中的曲线b所示，时间在40min内免疫电极的响应电流随着时间的延长而不断的增加，超出40min之后响应电流基本不变。此结果表明免疫反应需要时间是40min或40min后免疫反应已基本结束。因此在以后的实验中，40min被确定为g-chi-cunps-pab/ndv纳米复合物的最佳孵育时间。

特异性实验

用本实施例所制备的电化学免疫传感器分别检测ndv(f48e9)和其它病原体，除将待测样品替换为相应的病原体样品外，其它实验过程同上述ndv的检测过程相同，其中ndv的浓度为10⁵，其它病原体的浓度为eid5010⁶eid50。

其它病原体包括：传染性支气管炎(ibv),传染性喉气管(iltv),h5亚型禽流感病毒(aivh5),h7亚型禽流感病毒(aivh7),禽呼肠孤病毒(arv),传染性法氏囊病毒(ibd),ⅰ群禽腺病毒(aav)。

特异性实验结果如图4所示。图4结果显示，本实施例所制备的ndv电化学免疫传感器只有在ndv存在时峰电流值增高，而对其它病原体的检测其cv的峰电流值几乎不发生改变，即对其它病原体的检测为阴性，该实验结果表明本发明传感器特异性良好。

敏感性实验

对病毒液含量为10⁶eid50的ndv进行10倍倍比稀释，各取20μl用本实施例的传感器检测，实验结果如图5所示。图5结果表明，在ndv浓度为10¹时响应电流值仍然明显增高，因此该免疫传感器的最低检出量为10¹eid50。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。