一种基于HPLC指纹图谱评价僵蚕僵化程度的方法与流程

本发明属于中药质量控制领域，具体涉及一种基于hplc指纹图谱评价僵蚕僵化程度的方法。

背景技术：

僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕(bombyxmoril.)4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌(beauveriabassiana(bals.)vuillant)而致死的干燥体，具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结的功效，用于肝风夹痰、惊风抽搐、小儿急惊、破伤风、中风口风热头痛、目赤咽痛、风疹瘙痒、发颐痄腮等疾病的治疗。

僵蚕临床应用广泛，在513种人用成药中有49种含白僵蚕，64种儿科成药中含白僵蚕的有29种。《中国药典》、《国家中成药标准》、《中药成方制剂》和《新药转正标准》中共记录了175个含有僵蚕的中成药处方，如主治定惊豁痰、消积通便的“七珍丸”，清热镇惊，散风化痰的“小儿牛黄散”，祛风化痰，定痫止搐的“医痫丸”等。综上，僵蚕作为平肝熄风的药材，主要功效为“祛风定惊、化痰散结”。

中药标准化是中药现代化和国际化的先决条件。僵蚕的人工规范化生产是僵蚕产业发展的主要趋势和必然选择。然而，当前《中国药典》中僵蚕质量标准较低，无法对市场上的真伪僵蚕进行有效鉴别，也无法对僵蚕进行科学分级，导致人工规范化生产的僵蚕无法获得优质优价的收益，影响了僵蚕的标准化生产。

技术实现要素：

针对当前尚无法有效鉴定僵蚕僵化程度这一现状，本发明的目的在于提出一种基于hplc指纹图谱评价僵蚕僵化程度的方法，该方法通过建立不同僵化程度僵蚕的指纹图谱，实现鉴别僵蚕真伪和评价僵蚕品质的目的。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于hplc指纹图谱评价僵蚕僵化程度的方法，包括以下步骤：

(1)建立不同僵化程度僵蚕的hplc指纹图谱作为对照图谱；

所述不同僵化程度僵蚕至少应包括僵化5天以上的僵蚕；所述的僵化5天以上是从蚕感病死亡之时开始计算的；优选地，包括僵化5-9天的僵蚕；

步骤(1)中，供试品溶液的制备方法是：称取僵蚕粉，用80％(v/v)的乙醇溶液，以1:20的料液比超声波下提取60min，提取温度60℃；提取后过滤，蒸干，用甲醇定容，0.45μm微孔滤膜过滤，得到供试品溶液；

高效液相色谱分析的步骤是：吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪中进行检测，记录60min内的指纹图谱；

高效液相色谱分析的色谱条件是：柱温25℃，流速1.0ml/min，检测波长：360nm，进样量10μl，流动相a：0.4％冰乙酸溶液，流动相b：100％乙腈，采用梯度洗脱方式：从0-40min，流动相a的体积百分含量由95％降低至75％，流动相b的体积百分含量由5％提高至25％；从40-45min，流动相a的体积百分含量由75％降低至65％，流动相b的体积百分含量由25％提高至35％；从45-50min，流动相a的体积百分含量由65％降低至50％，流动相b的体积百分含量由35％提高至50％；

(2)以同样的方法和条件建立待测僵蚕样品的hplc指纹图谱；

(3)应用相似度评价系统比对待测僵蚕样品与不同僵化程度僵蚕的hplc指纹图谱，待测僵蚕样品拥有越高与僵化5天以上的僵蚕相同的相似度，则待测僵蚕样品的僵化程度越高。

所述的相似度评价系统优选《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》。

僵蚕的形成过程主要包括两个阶段。前一个阶段是家蚕和白僵菌的互作，白僵菌感染家蚕后诱发家蚕的防御应答，白僵菌也会通过营养竞争、分泌真菌毒素和破坏家蚕氧化还原平衡导致家蚕死亡。

后一个阶段是家蚕死亡后白僵菌的生物转化过程，也就是俗称的“僵化”阶段，白僵菌利用家蚕营养物质继续生长繁殖，并通过生物转化生成僵蚕的特有成分，从而构成僵蚕的药效物质基础。

本发明通过动物实验发现，僵蚕水提物的抗惊厥效果与僵化程度明显相关，僵化程度越高，僵蚕药用品质越好。因此，对僵蚕(粉)原料进行僵化程度的鉴别，有助于僵蚕的质量控制。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明提出了一种基于hplc指纹图谱评价僵蚕僵化程度的方法，该方法全面考虑了中药一般为多组分复杂体系这一因素，建立的僵蚕指纹图谱将能较为全面地反映僵蚕所含化学成分的种类与数量，进而从整体上对僵蚕僵化程度进行评价，是一种科学、客观、有效、高效的方法。

2、本发明的方法无需从僵蚕外观性状判定僵蚕僵化程度，可实现对完好僵蚕或僵蚕粉等各种形态僵蚕原料的品质评价。

附图说明

图1是实施例1中僵蚕水提物及醇提物对士的宁致痫小鼠死亡保护率的影响柱状图；其中，s：模型组，w1：水提物低剂量组，w2：水提物中剂量组，w3：水提物高剂量组，e1：醇提物低剂量组，e2：醇提物中剂量组，e3：醇提物高剂量组。

图2是不同僵化时间的僵蚕其外观变化。

图3是实施例2中不同僵化时间的僵蚕水提物对士的宁致痫小鼠死亡保护率的影响柱状图；其中，s：模型组，sw：正常蚕，d1：僵化1d僵蚕，d5：僵化5d僵蚕，d9：僵化9d僵蚕。

图4是正常蚕和不同僵化时间僵蚕的hplc色谱图。

图5是正常蚕和不同僵化时间僵蚕的特征指纹图谱；其中，sw-正常蚕，d1-僵化1天，d5-僵化5天，d9-僵化9天。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

僵蚕水提物和醇提物的抗惊厥效果比较：

为了解僵蚕对士的宁致痫小鼠的药效物质基础，通过动物实验对僵蚕水提物和醇提物的抗惊厥作用进行了测定。

僵蚕水提物的制备：称取僵蚕粉，料液比1:5-1:10，加水回流提取2次，每次1h，提取液过滤后真空浓缩，经冷冻干燥获得僵蚕水提物。

僵蚕醇提物的制备：称取僵蚕粉150g，以65％的乙醇溶液回流提取2次，料液比1:5-1:10，每次1h，提取液真空浓缩，经冷冻干燥获得僵蚕醇提物。

实验方法：

1、实验动物的饲养方法

实验动物为雄性spf级昆明小鼠，18～22g。购入后适应性喂养3d，然后将小鼠随机分组，每组10只。实验过程中对动物的饲养遵守实验动物管理与保护的有关规定。

2、造模及给药方法

用无菌水将水提物和醇提物溶解。按照预设剂量灌胃给药，模型组给予等体积的无菌水，连续灌胃5d。第6d给药30min后，腹腔注射1.6mg/kg的士的宁注射液，持续观察30min，记录小鼠的阵挛潜伏期(i-iii级的发作时间)、强直性惊厥潜伏期(v级发作)和30min内小鼠死亡的只数。通过视频监控小鼠痫性发作过程。

小鼠惊厥反应的观察参照racine标准：0级：无反应；i级：节律性口角、耳或面部肌肉抽动阵挛；ii级：点头并伴随更严重的面部肌肉抽动阵挛；iii级：出现前肢阵挛但不伴随直立；iv级：前肢阵挛伴随直立；v级：全身强直阵挛发作而跌倒。

3、动物实验数据统计

数据采用spss18.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准误表示，多样本均数的比较采用one-wayanova方差分析，组间比较采用lsd法。

实验设模型组、水提物和醇提物的低、中、高剂量组(以生药计给药剂量分别为10g/kg、20g/kg和30g/kg)，水提物和醇提物溶解时根据其得率进行相应换算。实验结果见表1和图1：

表1僵蚕水提物及醇提物对士的宁致痫小鼠的影响

与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。

由表1可以看出，僵蚕水提物高剂量组能够极显著延长小鼠阵挛潜伏期(p<0.01)和强直潜伏期(p<0.01)。僵蚕水提物中剂量组也能显著延长小鼠强直潜伏期(p<0.05)。

由图1可以看出，僵蚕水提物高剂量组还可以显著提高小鼠的死亡保护率。与模型组相比，醇提物对士的宁致痫小鼠的改善效果并不显著。

上述结果表明，僵蚕水提物对士的宁致痫小鼠的治疗效果较好，且呈现明显的剂量效应，是僵蚕抗惊厥的主要药效物质基础。

实施例2

僵化程度对僵蚕水提物抗惊厥药效的影响：

水提物制备：称取僵蚕粉，料液比1:5-1:10加水回流提取2次，每次1h以上，提取液过滤后真空浓缩，经冷冻干燥获得僵蚕水提物，得率为25.21％。

僵蚕僵化5天后体表已覆满白色孢子粉，呈现出典型的僵蚕特征。以僵蚕水提物进行不同僵化程度僵蚕的药效比较。对正常蚕和僵化1、5、9d的僵蚕进行热水提取，以生药计各样本的用药剂量均为25g/kg。结果如表2和图3所示：

表2不同僵化时间的僵蚕对士的宁致痫小鼠的影响

与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01

结果表明，僵蚕的药效与僵化程度明显相关(表2)。与模型组相比，僵化5d的僵蚕也能显著延长小鼠的阵挛潜伏期(p＜0.05)，僵化9d僵蚕能极显著延长小鼠的阵挛潜伏期(p＜0.01)，显著延长小鼠的强直潜伏期(p＜0.05)，还能显著改善小鼠的死亡保护率(图3)。各僵蚕样本药效依次为：d9＞d5＞d1＞sw，表明僵化时间越长，僵化程度越高，僵蚕的药用品质越好。

实施例3

一种基于hplc指纹图谱评价僵蚕僵化程度的方法，包括以下步骤：

(1)僵蚕僵化过程hplc指纹图谱的建立

分别建立正常蚕(即未感染白僵菌)和僵蚕不同僵化时间样本的hplc指纹图谱，如图4所示。

供试品溶液的制备：精确称取2.00g僵蚕粉，用80％的乙醇溶液，以1:20的料液比超声波下提取60min，提取温度60℃。提取后过滤，旋转蒸发仪减压蒸干，用甲醇定容至25ml容量瓶，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

高效液相色谱分析：

精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪中进行检测，记录60min内的指纹图谱。

色谱条件：色谱柱agilentzorbaxsb-c18(4.6mm×250nm，2.6μm)，二极管阵列检测器(dad)；柱温25℃，流速1.0ml/min，检测波长：360nm，进样量10μl，流动相a：0.4％冰乙酸溶液，流动相b：100％乙腈，采用梯度洗脱方式：从0-40min，流动相a的体积百分含量由95％降低至75％，流动相b的体积百分含量由5％提高至25％；从40-45min，流动相a的体积百分含量由75％降低至65％，流动相b的体积百分含量由25％提高至35％；从45-50min，流动相a的体积百分含量由65％降低至50％，流动相b的体积百分含量由35％提高至50％。

通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》对色谱峰进行自动匹配，匹配结果见表3。

表3正常蚕和不同僵化时间僵蚕指纹图谱峰保留时间及峰面积

从表3可以看出，4组样本共发现23个独立峰，其中共有峰仅有6个，如图5所示。

上述结果表明，与正常蚕sw相比，各僵蚕样本中化学成分的种类和含量均发生了剧烈变化。此外，不同僵化程度的僵蚕(d1、d5和d9)中，d5和d9的指纹图谱较为相似，与d1具有显著差异。

(2)hplc指纹图谱的相似度评价

进一步采用上述的相似度评价系统，计算四组指纹图谱的相似度，结果见表4。

表4僵蚕药材指纹图谱相似度

由表4可以看出，正常蚕和3组僵蚕的相似度在0.481～0.568之间，僵化1d的僵蚕和其它3组相似度在0.467～0.568之间，僵化5d和9d的僵蚕相似度为0.96，相似度较高。由此可见，利用指纹图谱可以有效鉴别真伪僵蚕和不同僵化程度的僵蚕。

(3)作待测样本hplc色谱图，和上述4种对照图谱进行比对，发现和僵化1d的僵蚕相似度高达0.95，说明僵化程度较低，品质较差。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。