肝素结合蛋白和降钙素原二联检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明属于生物诊断制品技术领域，具体涉及一种肝素结合蛋白和降钙素原二联检测试剂盒及其制备方法。

背景技术：

hbp为heparinbindingprotein的缩写，中文名称肝素结合蛋白，hbp具有杀菌作用，也参与炎症反应和凝血过程的调节。肝素结合蛋白是一种多功能的蛋白，可以通过结合血管上皮细胞，改变血管通透性，诱导血浆渗漏和炎症反应。肝素结合蛋白还能够趋化和激活单核白细胞和巨噬细胞，应对细菌感染，参与调节免疫反应。鉴于hbp丰富的功能性，以及特定浓度的改变，通过对hbp的检测，能够对某些相关疾病的辅助诊断具有很大的意义。缘此，市面上出现了一些hbp检测试剂盒，然而，这些检测试剂盒功能特效单一。

pct为procalcitionin的缩写，中文名称降钙素原。正常条件下，人血清pct含量极低，约2.5pg/ml。当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，pct在血浆中的水平升高。pct作为一项生物检测指标，提高了临床诊断的准确性，为重症监护、放化疗、服用免疫抑制剂或器官移植等患者合并发热时提供了极其重要的辅助诊断效果。缘此，市面上也出现了一些用于pct检测的试剂盒，然而，这些检测试剂盒功能特效单一。

双联检是将常规单一检测合二为一，在一根试纸条一次检测中同时进行两种蛋白的检测，既可简化检测操作，丰富检测输出数据，也能够降低假阴性的出现可能性，使检测结果更全面，为疾病的诊断分析提供更为真实有效的结果。由于不同目标物检测时采用的检测物质，表征方式迥异。双联检时，选择哪两种检测目标物进行组合，采用何种方式组合才能取得更好的灵敏性、特异性、较佳的线性和检测限，这都是需要考虑的问题。目前，hbp和pct的二联检检测试剂盒尚属市场空白。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种hbp和pct的二联检检测试剂盒，并且另一目的在于通过其制备方法的调整，获得更好的灵敏性、特异性、较佳的线性和检测限的二联检检测试剂盒。

本发明所采用的技术方案为：

首先，本发明提出一种肝素结合蛋白和降钙素原二联检测试剂盒，包括pvc板，以及设置在所述pvc板上且依次连接的吸水纸、nc膜、微球垫和样品垫，所述nc膜上设置有质控线c、检测线t2和检测线t1，所述质控线c处包被设置有dnp-bsa，所述检测线t2处包被设置有抗pct抗体ⅰ，所述检测线t1处包被设置有抗hbp抗体ⅰ，所述微球垫上包被设置有荧光标记的抗hbp抗体ⅱ和pct抗体ⅱ偶合物。

为了使得前述肝素结合蛋白和降钙素原二联检测试剂盒的灵敏性、特异性、更高，并且具有更佳的线性和检测限，本发明还对其制备方法进行了进一步优化改进，具体包括如下步骤：

s1：nc膜贴膜：将25*300mm的nc膜粘贴在78.5*300的pvc底板上，nc膜在pvc底板距两边的距离应为24.2±0.5mm、29.2±0.5mm。

s2：包被液配置：用磷酸盐缓冲液分别配制抗hbp抗体ⅰ包被液、抗pct抗体ⅰ包被液以及dnp-bsa包被液。

s3：nc膜的包被及干燥：将配制好的抗hbp抗体ⅰ包被液、抗pct抗体ⅰ包被液以及dnp-bsa包被液分别包被在nc膜上依次形成检测线t1、检测线t2和质控线c，干燥。

s4：化学偶合物垫的制备：将1％的海藻糖、0.1％酪蛋白和0.1％tween用te缓冲液补足定容，搅拌均匀得到混液一，取玻璃纤维膜置入混液一浸泡10分钟取出，45℃干燥得化学偶合物垫备用。

s5：荧光微球溶液的制备：取荧光微球加入活化稀释，超声分散，离心去上清；加入偶联液，超声分散，分别加入抗hbp抗体ⅱ和pct抗体ⅱ以及兔抗-dnp混合振荡反应，离心去上清，加入封闭液，超声分散，振荡反应，离心去上清，加入储存液，超声分散，得荧光微球溶液，2～8℃存放。

s6：微球垫的制备：将荧光微球溶液稀释后均匀的包被在干燥后的化学偶合物垫上，45℃干燥得微球垫。

s7：样品垫的制备：将2％的海藻糖、0.1％的酪蛋白、用2mm硼酸0.1％peg缓冲液定容，搅拌均匀得到混液二，取玻璃纤维膜置入混液二浸泡10分钟取出，45℃干燥得到样品垫备用。

s8：将包被及干燥好的nc膜、微球垫、样品垫以及吸水纸层压在一起，即得所述肝素结合蛋白和降钙素原二联检测试剂盒。

根据本发明的具体实施例，为了进一步便于实施，t1检测线与t2检测线间距为4.20mm，t2检测线与质控线c间距为4.20mm。

根据本发明的具体实施例，为了进一步便于实施，s2中，抗hbp抗体ⅰ包被液和抗pct抗体ⅰ包被液的浓度均为0.5-1.5mg/ml，dnp-bsa包被液的浓度为0.5-1mg/ml；s5中，抗hbp抗体ⅱ、抗pct抗体ⅱ以及兔抗-dnp加入后的浓度分别为0.1-0.3mg/ml、0.1-0.3mg/ml、0.05-0.15mg/ml。

本发明采用荧光免疫层析技术原理，通过双抗体夹心法进行检测。在试剂硝酸纤维素膜的检测线t1包被有抗hbp抗体ⅰ，检测线t2包被有抗pct抗体ⅰ，质控线c包被有dnp-bsa。检测时，样本中的hbp和pct抗原先与荧光标记的抗hbp抗体ⅱ和抗pct抗体ⅱ偶合物结合成免疫复合物，该免疫复合物依靠膜的层析作用移动至硝酸纤维素膜上，与检测线t1上的抗hbp抗体ⅰ发生反应从而被固定在检测线t1上形成双抗体夹心免疫复合物，同时，免疫复合物依靠膜的层析作用移动到t2检测线时，与预先包被的抗-pct抗体ⅱ发生反应从而被固定在t2线上形成双抗体夹心的免疫复合物。同时，荧光标记的兔抗dnp和未反应的免疫复合物与质控线c上包被的dnp-bsa结合。

通过本发明的具体实施例制备获得的肝素结合蛋白和降钙素原二联检测试剂盒，不经能够时间肝素结合蛋白和降钙素原一次进样，同步分别检测的效果。并且，检测效率高，检测时液体移行速度应不低于4mm/min。最低检出限hbp:≤1ng/ml、pct≤0.05ng/ml。在进一步的比对中，本发明的二联检测试剂盒准确性较高，测定值与理论值的相对偏差不超过±15％。在线性角度，本发明的二联检测试剂盒也取得了较佳的效果，hbp线性区间不窄于[1,10ong/ml],pct线性区间不窄于[0.1,5ong/ml]，且线性相关系数|r|不小于0.990。体现在重复性方面，用3批检测试剂线性范围内某一浓度的样本测试,所得结果的批间变异系数(cv)应不大于15％。本发明的二联检测试剂盒还具有较高的稳定性，在4～30℃条件下正常保存了18个月后，再行测试，仍保持了与出厂相近的各项参数数据。

附图说明

图1是本发明的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。

实施例：

本实施例提供一种肝素结合蛋白和降钙素原二联检测试剂盒，包括pvc板，以及设置在所述pvc板上且依次连接的吸水纸、nc膜、微球垫和样品垫，所述nc膜上设置有质控线c、检测线t2和检测线t1，所述质控线c处包被设置有dnp-bsa，所述检测线t2处包被设置有抗pct抗体ⅰ，所述检测线t1处包被设置有抗hbp抗体ⅰ，所述微球垫上包被设置有荧光标记的抗hbp抗体ⅱ和pct抗体ⅱ偶合物。

本实施例的肝素结合蛋白和降钙素原二联检测试剂盒具体通过以下步骤制备获取得到：

1、nc膜的制备

1.1nc膜贴膜：将25*300mm的nc膜粘贴在78.5*300的pvc底板上，要求：nc膜在pvc底板距两边的距离应为24.2±0.5mm、29.2±0.5mm。

1.2包被液的配制：用磷酸盐缓冲液配制t1检测线包被所用的抗hbp抗体ⅰ0.5mg/ml，t2检测线包被所用的抗pct抗体ⅰ0.5mg/ml，质控线c包被所用的dnp-bsa0.3mg/ml。

1.3nc膜的包被及干燥：将配制好的包被液分别包被在已贴好nc膜的pvc底板上，t1检测线与t2检测线间距为4.20mm，t2检测线与质控线c间距为4.20mm，包被完成37℃干燥过夜。

2、封闭化学偶合物垫及样品垫

2.1制备化学偶合物垫：将1％的海藻糖、0.1％酪蛋白，0.1％tween用te缓冲液定容至所需体积，搅拌均匀，置入玻纤浸泡10分钟，取出45℃干燥得到化学偶合物垫备用。

2.2制备样品垫：将2％的海藻糖、0.1％的酪蛋白、用2mm硼酸0.1％peg缓冲液定容至所需体积，搅拌均匀，置入玻纤浸泡10分钟，取出45℃干燥备用。

3、荧光微球标记和包被

3.1标记：荧光微球加入活化液进行稀释，超声分散，离心去上清；加入偶联液恢复至原体积，超声分散，分别加入抗hbp抗体ⅱ和pct抗体ⅱ以及兔抗-dnp混合振荡反应，离心去上清；加入封闭液至原体积，超声分散，振荡反应，离心去上清；加入储存液至原体积，超声分散得到荧光微球溶液，2～8℃冰箱存放。

3.2包被：将已标记好的荧光微球溶液稀释，均匀包被在化学偶合物垫上，45℃干燥过夜得到微球垫。

4、装配：将已包被干燥好的nc膜、已包被并干燥的微球垫、已封闭的样品垫及吸水纸层压在一起，切成4.0mm±0.1mm的试剂条，装入卡壳，用铝箔袋密封好。

基于本实施例的进一步改进的其他实施例中，步骤1.2中，t1检测线包被所用的抗hbp抗体ⅰ的溶液浓度可以是0.8mg/ml或1.5mg/ml，t2检测线包被所用的抗pct抗体ⅰ的溶液浓度可以是0.8mg/ml或1.5mg/ml，dnp-bsa包被液的浓度为0.7mg/ml或1mg/ml；步骤3.1中，加入抗hbp抗体ⅱ和抗pct抗体ⅱ以及兔抗-dnp后，抗hbp抗体ⅱ的浓度为0.1或0.3mg/ml，抗pct抗体ⅱ的浓度为0.1mg/ml或0.3mg/ml，兔抗-dnp的浓度为0.05mg/ml或0.15mg/ml。

本实施例的二联检测试剂盒的使用方法如下：无菌情况下用一次性真空采血管采集人血浆样本。临床样本采集后，若在24小时之内检测可暂存于2～8℃待检；若24小时之内不能检测，应于-20℃或以下温度可保存3个月内随时待检。具体检测时：检测前将试剂盒、样本恢复至室温(15～30℃)，将70μl样本滴加至样品垫，待反应15分钟后，通过干式荧光免疫分析仪检测试剂的荧光强度，从而获得荧光强度值，荧光分析仪将荧光强度值拟合至剂量-反应曲线，进而换算出肝素结合蛋白/降钙素原二联相应的浓度值(ng/ml)。

取前述实施例所获得的肝素结合蛋白和降钙素原二联检测试剂盒，采用行业通用方式进行效果测试，相关参数测试情况如下：

1.液体移行速度

检测方法：随机取本发明的二联检测试剂盒，加入样品后观察检测窗口，当液体开始检测窗口内时开始用秒表(精度为0.1s)计时，当液体完全移行出检测窗口时停止计时，所用的时间记为(t)，用游标卡尺(精度为0.02mm)测量检测窗口的长度，记为(l)，计算l/t即为移行速度，计算平均值，

检测结果：液体的移行速度不低于4mm/min。

2.最低检测限

检测方法：取不同浓度梯度的低浓度值样本进行检测,每份样本检测5次,对检测结果按照大小进行排序,符合如下条件,即可得到空白限和检出限的范围：低于空白限数值的检测结果的数量应小于或等于3个。

检测结果：hbp最低检测限≤1ng/ml；pct最低检测限≤0.05ng/ml。

3.准确度

检测方法：根据线性区间,用hbp/pct抗原配制成已知3个浓度企业参考品作为样本进行检测,每个样品重复测定3次，测试结果记为(xi),按式(1)分别计算相对偏差(bi)。

bi＝(xi—t)/t*100％………………(1)

式中:

bi——相对偏差；

xi——测量浓度；

t——标定浓度。

检测结果：用hbp/pct抗原配制成已知浓度作为样本进行检测,测定值与理论值的相对偏差不超过±15％。

4.线性

检测方法：用hbp/pct抗原配制成已知5个浓度企业参考品作为样本进行检测。对每一个浓度的样本至少重复测定3次，计算其平均值，将测定浓度的平均值与理论浓度进行线性方程拟合，得到线性回归方程，并计算线性相关系数r。

检测结果：hbp线性区间不窄于[1,10ong/ml],pct线性区间不窄于[0.1,5ong/ml]；线性相关系数|r|不小于0.990。

5.重复性

检测方法：随机抽取同一批次20个二联检测试剂盒，用hbp/pct抗原配制成已知某个浓度企业参考品作为样本进行检测,分别计算10次测定结果的平均值(m)和标准差(sd),根据式(3)得出变异系数(cv)。

cv＝sd/m×100％………………(3)

式中:

cv——变异系数；

sd——10次测量结果的标准差；

m——10次测量结果的平均值。

检测结果：用线性范围内某一浓度的样本重复检测10次,所得结果的变异系数(cv)不大于15％。

6.批间差

检测方法：取3个不同批号试剂盒,用hbp/pct抗原配制成已知某个浓度企业参考品作为样本进行检测分别重复测定10次,计算30次测定结果的平均值(m)和标准差(sd),根据式(3)得出变异系数(cv)。

检测结果：用3批检测试剂线性范围内任一浓度的样本测试,所得结果的批间变异系数(cv)不大于15％。

7.稳定性

4～30℃保存18个月后，进行试剂检出限、准确度、线性和重复性等测试，依然满足前述各参数情形。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。