一种快速检测牛肉冻融程度的方法与流程

本发明肉类品质检测领域，涉及牛肉冻融程度检测方法，尤其涉及一种利用电解质栅控石墨烯晶体管(sggt)快速检测不同冻融次数牛肉的方法。

背景技术：

目前，市场上销售的牛肉基本分为冷鲜肉和冷冻肉。采用冷冻的方式长时间储藏牛肉一方面延长牛肉的保质期，扩大销售半径，另一方面也有利于市场调控和维持物价。然而，在肉类冷冻过程中产生的冰晶及产生的盐浓度增加，将会降低肉制品的品质，如造成组织损伤、蛋白质变性、油脂氧化、颜色恶化等。尤其是由于肉制品在流通过程中的冷链不完善，导致冷冻肉反复冻融，更容易使肉制品发生污染，甚至变质。而冷鲜肉由于未经过冻结，因此在风味、营养及加工特性上都要好于冷冻肉。但由于冷鲜肉和冻融肉在形状、颜色和纹理等方面相似，所以很难将其区分开来。近些年来，市场上存在着大量的冻融牛肉作为新鲜牛肉售卖的欺诈行为。

针对于此，目前虽然存在着一些基于冷冻肉冻融过后成分变化(如酶活性、水分、dna、组织结构等)进行分类鉴别的方法。中国专利文献cn107389656a公开了一种用于表征反复冻融过程中牛肉脂肪品质变化的方法，该方法通过对牛肉进行反复冻融处理，对解冻后的牛肉进行脂肪提取，再利用激光拉曼光谱仪对提取的脂肪进行拉曼光谱扫描，通过分析拉曼光谱，实现对于反复冻融过程中牛肉脂肪品质变化的表征。然而，该方法需要复杂的样品处理、检测设备昂贵，存在检测缺少实时性、设备投入大等不足。中国专利文献cn103760193a公开了一种禽肉冻融次数快速鉴别方法，该专利基于肉在冷冻并解冻后细胞膜收到破坏，电容作用减小这一原理，通过建立神经网络判别模型，将不同种类肉纷杂的阻抗差异特点统一分析，后续测量只需要对特征频点信息进行采集，所需要的设备简单。但由于该方法需要建立神经网络模型，模型建立过程的复杂性以及最终建立的模型的准确性导致该方法的使用具有局限性。

可见，现有技术中对于冷冻肉，尤其是冷冻牛肉的冻融程度的检测存在检测过程复杂、所需设备成本高昂等问题。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提出了一种快速检测牛肉冻融程度的方法，该方法基于电解质栅控石墨烯晶体管的电化学检测平台，对牛肉渗出液中的高铁血红素成分进行快速实时检测，并以牛肉渗出液中的高铁血红素含量为主要的指标来预测评估牛肉的冻融程度，具有测试方法简单快速、设备投入少的特点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种快速检测牛肉冻融程度的方法,该检测方法通过电解质栅控石墨烯晶体管(sggt)传感器检测冻融过程中牛肉的高铁血红素损失量判断牛肉冻融程度，该检测方法包括如下步骤：

(1)制作电解质栅控石墨烯晶体管(sggt)，并组装血红素含量检测传感器；

(2)测定传感器沟道电流对应血红素含量的实时响应关系；

(3)待检测牛肉样品冻融处理，获取血红素液体样品

(4)利用所述传感器检测所述血红素液体样品，并依据传感器沟道电流对应血红素含量的所述实时响应关系获取冻融过程中牛肉的血红素损失量；

(5)根据所述血红素损失量判断牛肉样品冻融程度。

根据优选地技术方案，所述步骤(2)、(4)中，施加在晶体管栅极的电压vg大于dirac点电压。

根据优选地技术方案，在所述步骤(2)中，测定沟道电流对应血红素含量的实时响应曲线，并计算不同浓度下的归一化电流响应，以建立传感器的工作标准曲线。

根据优选地技术方案，在栅极电压vg＝0.3v的条件下,所述传感器的工作标准曲线为y＝0.07956x+0.54315；在栅极电压vg＝0.7v的条件下，所述传感器的工作标准曲线为y＝0.1598x+1.13765。

根据优选地技术方案，所述步骤(4)中，利用血红素损失率i损表征血红素损失量，i损＝c渗出/c总，其中c渗出表示牛肉冻融渗出液中的血红素含量，c总表示牛肉中总的高铁血红素含量。

根据优选地技术方案，所述步骤(5)中，依据高铁血红素损失率与冻融次数关系曲线判断牛肉样品冻融程度。

根据优选地技术方案，所述步骤(1)中，在将石墨烯转移到图案化基底的源极与漏极之间之前，对源极和漏极电极表面进行预处理。

根据优选地技术方案，所述预处理为等离子清洗。

与现有技术相比，本发明公开的基于溶液栅控石墨烯晶体管传感器的牛肉冻融程度的检测方法，通过高铁血红素吸附在单层石墨烯表面，从而改变石墨烯掺杂水平，产生电流信号的变化。该方法可实现对于牛肉渗出液及牛肉中的高铁血红素的高灵敏度检测，通过两个参数的比值得到牛肉中高铁血红素的损失率，进而推断出牛肉受到冻融的程度。本发明对于不同冻融次数牛肉的鉴别具有响应快速、可实时检测、样品处理简单、制作成本低、无需复杂电极修饰、工作电压低(一般小于1v)等优点。

附图说明

图1为现有酸化丙酮法检测血红素的方法流程图；

图2为本发明制作的sggt组装结构示意图；

图3为本发明提出的快速检测牛肉冻融程度的方法流程图；

图4为本发明制作的sggt流程图；

图5为栅极电压vg＝0.7v的条件下沟道电流ids随时间的变化曲线；

图6为栅极电压vg＝0.7v的条件下本发明传感器的工作标准曲线；

图7为栅极电压vg＝0.3v的条件下沟道电流ids随时间的变化曲线；

图8为栅极电压vg＝0.3v的条件下本发明传感器的工作标准曲线；

图9为高铁血红素损失率与冻融次数对应关系曲线；

图10为本发明传感器的工作标准曲线与传统分光光度法测定曲线对比关系图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细地描述。

研究发现，经过不同冻融次数的牛肉，由于冷冻过程中产生的冰晶对于牛肉组织及细胞膜的破坏，其渗出液中流失的高铁血红素含量也存在差别。基于此，本发明试图通过提取冻融牛肉渗出液中的血红素含量来判断牛肉的冻融次数等冻融程度，进而对牛肉的品质进行评估。

对于血红素本身的检测已存在多种已有技术。然而，常规的血红素检测方法往往需要复杂的样品处理、昂贵的检测设备，并且专业的操作人员。例如图1所示的通过酸化丙酮法检测血红素的方法流程。该方法需要先收集市场上待测的样品，将其粉碎匀浆，使用酸化丙酮提取样品中的血红素，于黑暗处孵化一段时间后，离心取上清，测量其分光度值，最后通过分光度值来计算血红素含量。这种方法虽然能比较准确地测量样品中的血红素含量，但是其需要复杂的样品处理及专业的仪器设备，并且无法进行实时检测，不能快速的得出检测结果。

有鉴于此，本发明提出了一种利用溶液栅控石墨烯晶体管作为传感器的电化学方法，来进行冻融牛肉的实时检测。

溶液栅控石墨烯晶体管(sggt：solution-gatedgraphenetransistor)，指电解质栅控石墨烯晶体管，是一种具有石墨烯晶体管的场效应晶体管，其与沟道连接的是电解质溶液，而不是绝缘层，本身就相当于传感器与放大器的组合。由于sggt具有成本低、制作简单、工作电压低等优点，在dna、葡萄糖等生物传感器领域被广泛应用。

本发明研制了可以检测高铁血红素的电解质栅控石墨烯晶体管，其组装成传感器的结构示意图如图2所示。参照图2，该电解质栅控石墨烯晶体管包括形成在玻璃基底6上的栅极1、源极2、漏极3以及覆盖在源极2和漏极3之间的单层石墨烯沟道4，将晶体管安装在装有磷酸盐缓冲液5(pbs：phosphatebufferedsaline)的容器中，使所述磷酸盐缓冲液5作为电解质溶液充当石墨烯沟道4与栅极1之间的绝缘层，栅极电压通过石墨烯与电解质界面的双电层施加于石墨烯沟道。

当在所述磷酸盐缓冲液5加入高铁血红素时，高铁血红素通过π-π相互作用吸附在石墨烯沟道表面，导致石墨烯掺杂水平发生改变，沟道电流也会随之发生变化，进而通过沟道电流变化来确定高铁血红素浓度。本发明制作的石墨烯晶体管呈现出双极特性：在工作栅极电压高于dirac点电压时，沟道电流随高铁血红素浓度上升而上升；在工作栅极电压低于dirac点电压时，沟道电流随高铁血红素浓度上升而上下降。

如图3所示，本发明提出的检测方法主要包括以下步骤：样品处理、传感器制作、高铁血红素检测、评估牛肉质量。其中，本领域技术人员容易理解，样品处理和传感器制作步骤无严格先后顺序。以下将对本发明提出的检测方法进行具体描述。

首先，进行溶液栅控石墨烯晶体管的制作及牛肉样品的处理。

本发明制作溶液栅控石墨烯晶体管的制作流程如图4所示，主要包括如下步骤：

(1)制作基底。用玻璃刀把载玻片切割成1cm×1cm的小玻璃片作为基底，将玻璃基底依次用丙酮、乙醇、去离子水超声清洗20-30分钟。

(2)制作图案化电极。用高纯氮气将玻璃基底吹干后，通过高温胶带将玻璃基底固定在掩膜板上，利用磁控溅射在玻璃基底沉积上图案化的铬/金电极。沉积电极时先沉积铬层，厚度约8-10nm，优选10nm；再沉积金层，厚度为90-120nm，优选100nm。沉积铬层的作用主要是为了增加金与玻璃基底的粘附性，避免金电极出现脱落破损。

(3)制备单层石墨烯。采用ch4(40sccm)和h2(20sccm)的混合气体通过化学气相沉积(cvd)在1000℃下合成单层石墨烯，并用25μm厚的cu箔作催化底物。再将聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)薄膜旋涂在石墨烯上。为了使pmma在石墨烯上旋涂的更加均匀，采用两步法旋涂：先是慢速800rpm，旋涂10-12秒，再是快速2000rpm，旋涂20-25秒。然后浸入刻蚀溶液(cuso4：hcl：h2o＝10g：50ml：50ml)中，以刻蚀cu基底，并用蒸馏水洗涤3-5次。

(4)石墨烯转移。在转移前对源极和漏极电极表面采用化学或物理方法进行预处理，以提高电极的检测灵敏度。本发明选择利用等离子清洗的方法对所述电极进行预处理。然后，使用湿法转移的方法，将石墨烯转移到图案化基底的源极与漏极之间，并在120℃下退火处理15-20分钟。最后，将退火后的基底放入50-60℃的丙酮中浸泡1-1.5小时，更换新的丙酮后重新浸泡，重复3-4次。

(5)器件封装。将连接源极、漏极和栅极的金属线用防水的硅氧烷层进行防水密封保护，以防止在传感器测试过程中与电解质接触而造成短路。

在电解质栅控石墨烯晶体管制作完成后，需要确定传感器对于血红素的响应曲线。具体步骤如下：

(1)组装传感器。按照图2所示的结构组装传感器，将具有栅极1、源极2、漏极3三个电极及单层石墨烯沟道4的晶体管安装在装有10ml的磷酸盐缓冲液(0.1m，ph值＝7.4)的小烧杯中。

(2)测定沟道电流实时响应曲线(ids-t)。本发明中通过labview软件控制的两个keithley2400多功能电源电表进行实时电流监测，在固定源极电压vds＝0.05v和栅极电压vg＝0.7v的条件下，测定沟道电流ids随时间的变化。等到通道电流ids基本不发生变化时，以此电流值为初始电流i0，然后开始向磷酸盐缓冲液中加入不同浓度的高铁血红素溶液，每次间隔10min，记录不同浓度下的传感器升高的电流值in，测量结果如图5所示。

(3)计算不同浓度下的归一化电流响应：ncr＝(in-i0)/i0。以高铁血红素浓度的对数值作为横坐标，建立本发明传感器的工作标准曲线为y＝0.1598x+1.13765。研发发现，本发明传感器的检测限可以达到10nm，线性范围为100nm-10μm，具体结果如图6所示。

根据本发明的另一实施例，在上述测定沟道电流实时响应曲线的步骤(2)中，在其他条件不变的情况下，在栅极电压vg＝0.3v的条件下测定沟道电流ids随时间的变化，最终测量结果如图7所示。对应地，步骤(3)中以高铁血红素浓度的对数值作为横坐标，建立本发明传感器的工作标准曲线为y＝0.07956x+0.54315。传感器的检测限为100nm，线性范围为300nm-10μm，具体结果如图8所示。

由此可见，尽管本发明制作的石墨烯晶体管呈现出双极特性，但在工作栅极电压(vg＝0.7v)高于dirac点电压时，传感器可以获得更高的检测精度，并且传感器的线性范围更宽。

由于不同牛肉样品中初始高铁血红素含量不同会造成初始渗出液的差异，并且渗出液中其他成分也会对高铁血红素含量检测结果产生干扰，因此仅以高铁血红素含量判断冻融次数有可能存在较大误差。为了减少上述干扰因素，提高检测准确度，本发明通过计算渗出液中高铁血红素含量与牛肉样品中总的高铁血红素含量的比值i损＝c渗出/c总，并以该值i损来代表牛肉的高铁血红素损失率。

根据优选的实施方式，本发明通过以下方法获得i损：

(1)实际样品处理。

实际样品预处理：将牛后腿肉去筋膜，切割成i小块，3≦i≦5，体积约5cm×5cm×4cm。将上述样品真空封装在小的包装袋中，并按顺序标记k1、k2、ki……。对上述样品分别进行1-i次冻融处理，冻融条件为：-20℃冷冻24h；4℃解冻24h。

(2)血红素提取

针对标号k1、k2、ki……的每一份样品，分别进行如下操作：

浸出液的获取：取20g牛肉样品加入到20ml、0.1m的磷酸盐缓冲液中，混合均匀后于黑暗处浸提30-40分钟，在温度4℃、转速10000g条件下离心10-15min，取上清液经玻璃纤维抽滤装置过滤后，得到渗出液样品。

牛肉中总的高铁血红素的提取：取5g牛肉样品加入到20ml、0.1m的磷酸盐缓冲液中，使用高速分散机10000rpm均质30-40秒，置于黑暗避光处孵育1-1.5小时，在温度4℃、转速10000g条件下离心10-15min，取上清液经玻璃纤维抽滤装置过滤后，得到总高铁血红素液体样品。

(3)高铁血红素损失的测定。在固定源极电压vds＝0.05v和栅极电压vg＝0.7v的条件下，测定沟道电流ids随时间的变化。等到通道电流ids基本不发生变化时，以此电流值为初始电流i0，然后向磷酸盐缓冲液中加入每一份样品k1、k2、ki……的渗出液样品或总高铁血红素液体样品，记录升高的沟道电流in，并计算归一化电流响应，然后根据本发明的传感器在vds＝0.05v，vg＝0.7v的工作曲线(参见图6)得到每一份样品k1、k2、ki……的渗出液样品中的高铁血红素含量c渗出及牛肉中总的高铁血红素含量c总，并计算每一份样品k1、k2、ki……的高铁血红素损失率i损＝c渗出/c总。

由于上述每一份样品k1、k2、ki……的冻融次数不同，进而可以获得高铁血红素损失率i损与冻融次数的关系曲线。如图9所示，本发明测定了i＝3的关系曲线。可以看出，随着冻融次数的增加，其高铁血红素损失率也在增加。据此，我们可根据牛肉中高铁血红素的损失量来判断牛肉的冻融程度。

图10示出了根据传统的酸化丙酮分光光度法测定的冻融次数与高铁血红素损失率之间的关系曲线(以虚线表示)与采用本发明测定的冻融次数与高铁血红素损失率与之间的关系曲线(以实线表示)。可以看出两条曲线的非常接近，因此也验证了本发明的可行性。

本发明采用电解质栅控石墨烯晶体管传感器的电化学方法来进行冻融牛肉的实时检测。电解质栅控石墨烯晶体管由三个金电极(源极、漏极、栅极)和一个石墨烯沟道组成，主要应用在溶液体系中化合物的电化学检测。本发明有别于传统的场效应晶体管用电解质溶液来代替绝缘层与石墨烯沟道与栅极接触，栅极的电压相当于施加在栅极/电解质和电解质/沟道两个界面处，每个界面处都有一个双电子层，相当于一个电容，可以通过栅极电压来调控沟道电流的变化，且每个石墨烯晶体管相当于一个传感器和一个放大器的结合。电解质栅控石墨烯晶体管由于具有工作电压低(一般小于1v)、快速实时、灵敏度高、成本低、易制作等优点，可将其应用在食品质量安全的检测领域。

以上实施方式仅用以说明本发明实施例的技术方案而非限制，尽管参照以上较佳实施方式对本发明实施例进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明实施例的技术方案进行修改或等同替换都不应脱离本发明实施例的技术方案的精神和范围。