一种检测EGFR的化学发光试剂盒的制作方法

本实用新型涉及医学免疫体外诊断试剂领域，具体涉及一种检测EGFR的化学发光试剂盒。

背景技术：

表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor；EGFR)是表皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170kDa。在科研和生产过程中，需要测定溶液中EGFR蛋白含量变化，来监控实验条件和监控生产过程。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，均会引起肿瘤、糖尿病、免疫缺陷及心血管疾病的发生。

目前EGFR测定方法有胶体金免疫层析(GICA)；蛋白质印迹(WB)；酶联免疫吸附试验(ELISA)，化学发光法免疫分析(CLIA)；GICA、ELISA、WB的优点是相对成本低廉，缺点是灵敏度低，EGFR蛋白含量少的情况下检测不出，CLIA作为非放射性的免疫分析法，具有灵敏度高、所需时间短、无污染、检测范围宽等特点，随着各种自动发光分析仪器面世，以及不同类型的化学发光免疫分析试剂盒的不断推出，成为时间分辨、放射免疫、酶联免疫分析的取代者，但目前市场上针对EGFR的化学发光试剂盒还很少。

技术实现要素：

本实用新型的目的在于提供一种检测EGFR的化学发光试剂盒，填补了市场上EGFR的化学发光试剂盒的空白，具有检测结果灵敏度高、检测范围宽等优点。

为实现上述目的，本实用新型提供如下技术方案：

一种检测EGFR的化学发光试剂盒，包括试剂盒盒体、试剂盒盒体内的试剂瓶和固相载体，所述试剂瓶包括2个大号试剂瓶、3个中号试剂瓶、8个小号试剂瓶，2个大号试剂瓶中分别装有浓缩洗涤液、稀释液，3个中号试剂瓶分别装有酶标抗体、化学发光底物液A、化学发光底物液B，8个小号试剂瓶分别装有阳性对照、阴性对照、6个标准品溶液，所述试剂盒盒体包括盒本体、盒盖，所述盒盖罩盖在盒本体上，盒盖内表面设有一圈密封垫，盒盖外表面的四个顶角处设有第一缺口，第一缺口的截面为正方形结构，第一缺口的高度为d1,盒本体内部设有固定垫、减震垫，所述固定垫、减震垫上均设有13个试剂瓶孔，固定垫、减震垫试剂瓶孔的位置相对应，减震垫位于固定垫下方，固定垫与减震垫通过第一连接条相连接，盒本体下表面四个顶角处设有防滑垫，防滑垫的截面为正方形结构，防滑垫的大小、形状与第一缺口相匹配，防滑垫的高度为d2,d2＝d1。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述试剂盒盒体为PMMA材质。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述密封垫为橡胶材质。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述减震垫、固定垫、第一连接条为泡沫材质。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述防滑垫为PVC材质、PU材质、硅胶材质中的一种。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述固相载体为聚苯乙烯材质的96孔微量滴定板。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述固相载体包被EGFR抗体，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的EGFR抗体，化学发光底物液A为含有5ug/mL对碘苯酚、5.0mg/mL鲁米诺的Tris-HCl缓冲液(0.1M、pH＝8.5)，化学发光底物液B为含有100mg/mL过氧化氢、15mg/mL辣根过氧化氢酶的柠檬酸缓冲液(0.1M、pH＝4.5)。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述稀释液是将100ml牛血清白蛋白、20ml重量百分比浓度为1％的硫柳汞、10ml浓度为0.1M铁氰化钾、0.5ml的吐温-20、10ml浓度为10mg/ml的庆大霉素、余量为PBS缓冲液(0.01M、pH＝7.4)定容至1000ml混合得到的溶液。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液是将重量为2.96g的NaH2PO4·2H2O、重量为29g的Na2HPO4·12H2O、重量为234g的NaCl和20ml吐温-20，加双蒸水定容至1000ml混合得到的溶液。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述阳性对照由EGFR阳性血清配制，所述阴性对照由健康人血清配制，所述标准品溶液为6个浓度梯度的EGFR抗原，所述浓度依次为：0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml。

本试剂盒使用时还需用到包被缓冲液、封闭液，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(0.03mol/L、pH＝9.6)，所述封闭液是将0.01g叠氮化钠、10g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.03mol/L磷酸盐溶液(pH＝7.4)混合得到的溶液。

本实用新型具有有益效果：本实用新型辣根过氧化物酶标记的EGFR抗体与微孔板上包被的EGFR抗体和待测样品形成“固相包被抗体-待测抗原-酶标抗体”的夹心复合物结构，因此本实用新型采用的双抗体夹心法，既有效地利用了化学发光技术原理，又应用辣根过氧化物酶催化发光底物鲁米诺，检测鲁米诺产生的光信号，灵敏度大大提高，比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约10倍，可为临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

附图说明

图1为本实用新型结构示意图；

图2为图1的俯视图；

图3为盒盖上表面示意图；

图4为图3的仰视图；

图5为固定垫、减震垫、第一连接条示意图；

图6为试剂瓶示意图；

图中：1-盒本体，2-大号试剂瓶，3-中号试剂瓶，4-小号试剂瓶，5-盒盖，6-密封垫，7-第一缺口，8-固定垫，9-减震垫,10-试剂瓶孔，11-第一连接条，12-防滑垫。

具体实施方式

下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、化学发光试剂盒的结构

如图1-6所示，一种检测EGFR的化学发光试剂盒，包括试剂盒盒体、试剂盒盒体内的试剂瓶和固相载体，所述试剂瓶包括2个大号试剂瓶、3个中号试剂瓶、8个小号试剂瓶，2个大号试剂瓶中分别装有浓缩洗涤液、稀释液，3个中号试剂瓶分别装有酶标抗体、化学发光底物液A、化学发光底物液B，8个小号试剂瓶分别装有阳性对照、阴性对照、6个标准品溶液，所述试剂盒盒体包括盒本体1、盒盖5，所述盒盖罩盖在盒本体上，盒盖内表面设有一圈密封垫6，盒盖外表面的四个顶角处设有第一缺口7，第一缺口的截面为正方形结构，第一缺口的高度为d1,盒本体内部设有固定垫8、减震垫9，所述固定垫、减震垫上均设有13个试剂瓶孔10，固定垫、减震垫试剂瓶孔的位置相对应，减震垫位于固定垫下方，固定垫与减震垫通过第一连接条11相连接，盒本体下表面四个顶角处设有防滑垫12，防滑垫的截面为正方形结构，防滑垫的大小、形状与第一缺口相匹配，防滑垫的高度为d2,d2＝d1。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述试剂盒盒体为PMMA材质。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述密封垫为橡胶材质。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述减震垫、固定垫、第一连接条为泡沫材质。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述防滑垫为PVC材质、PU材质、硅胶材质中的一种。

上述一种检测EGFR的化学发光试剂盒，其中，所述固相载体为聚苯乙烯材质的96孔微量滴定板。

本试剂盒盒体为PMMA材质，更加坚固耐用，在运输过程中不会轻易损坏，盒盖上表面设有第一缺口，盒本体下表面设有防滑垫，防滑垫与第一缺口相匹配，若干试剂盒堆叠在一起时，一方面节省空间，另一方面不会轻易倒塌，便于运输，盒盖内表面设有密封垫，试剂盒盒体内设有减震垫和固定垫，能起到固定和保护试剂瓶的作用。

实施例2、化学发光试剂盒的组成

本试剂盒包括述浓缩洗涤液、稀释液、酶标抗体、化学发光底物液A、化学发光底物液B，阳性对照、阴性对照、标准品溶液、包被缓冲液、封闭液。

所述固相载体包被EGFR抗体，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的EGFR抗体，化学发光底物液A为含有5ug/mL对碘苯酚、5.0mg/mL鲁米诺的Tris-HCl缓冲液(0.1M、pH＝8.5)，化学发光底物液B为含有100mg/mL过氧化氢、15mg/mL辣根过氧化氢酶的柠檬酸缓冲液(0.1M、pH＝4.5)。

所述稀释液是将100ml牛血清白蛋白、20ml重量百分比浓度为1％的硫柳汞、10ml浓度为0.1M铁氰化钾、0.5ml的吐温-20、10ml浓度为10mg/ml的庆大霉素、余量为PBS缓冲液(0.01M、pH＝7.4)定容至1000ml混合得到的溶液。

所述浓缩洗涤液是将重量为2.96g的NaH2PO4·2H2O、重量为29g的Na2HPO4·12H2O、重量为234g的NaCl和20ml吐温-20，加双蒸水定容至1000ml混合得到的溶液。

所述阳性对照由EGFR阳性血清配制，所述阴性对照由健康人血清配制，所述标准品溶液为6个浓度梯度的EGFR抗原，所述浓度依次为：0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml。

本试剂盒使用时还需用到包被缓冲液、封闭液，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液(0.03mol/L、pH＝9.6)，所述封闭液是将0.01g叠氮化钠、10g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.03mol/L磷酸盐溶液(pH＝7.4)混合得到的溶液。

实施例3、试剂盒的制备方法

以EGFR阳性血清配制阳性对照，以健康人血清配制阴性对照，以EGFR阳性血清配制标准品，微量滴定板包被EGFR抗体，辣根过氧化物酶标记EGFR抗体，配制化学发光底物液A和B，配制浓缩洗涤液和稀释液，分装上述组份，以及组装为成品。

(1)包被：用30mM pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成包被浓度为2ug/ml的EGFR抗体包被缓冲液，并将包被缓冲液负载于微量滴定板(100ul/孔)，2-8℃包被18-24小时。

(2)封闭：用0.01g叠氮化钠、10g牛血清白蛋白和100mL浓度为0.03mol/L磷酸盐溶液(pH＝7.4)混合得到的封闭液封闭上述洗涤后的微量滴定板。

(3)酶标抗体：取HRP5mg溶于0.2mol/L，pH＝5.6醋酸盐缓冲液1ml中，加入1％DNFB无水乙醇溶液0.1ml，室温下轻微搅拌1h，加入新鲜配置的0.1mol/LNaIO4 0.5ml，此时溶液由原棕色变为墨绿色，4℃放置30min，此时溶液由原棕色变为墨绿色，加入2.5％乙二醇1ml，室温下轻微搅拌1h，终止反应，加入待标记的抗体5-10mg，用1mol/L，pH＝9.5碳酸盐缓冲液，调节pH值至9.0，混匀，置4℃过夜；加入硼氢化钠溶液0.1ml，混匀，4℃放置3h，对0.01mol/L，pH＝7.4磷酸盐缓冲液，4℃透析过夜，换液3次，3000r/min离心30min，去除沉淀物，收集上清液即为酶标抗体。

(4)化学发光底物：化学发光底物液A为含有5ug/mL对碘苯酚、5.0mg/mL鲁米诺的Tris-HCl缓冲液(0.1M、pH＝8.5)，化学发光底物液B为含有100mg/mL过氧化氢、15mg/mL辣根过氧化氢酶的柠檬酸缓冲液(0.1M、pH＝4.5)。

实施例4、本试剂盒的使用方法

(1)从2-8℃冰箱中取出包被后的微量滴定板，室温放置15分钟。

(2)设阳性对照、阴性对照、标准品各2孔每孔50ul，待测样本50ul，振荡混匀后37℃温育30分钟。

(3)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

(4)每孔分别加入100uL酶标抗体，37℃温育20分钟。

(5)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

(6)每孔加化学发光底物液A、B各50μL，用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(20～25℃)避光反应5分钟。

(7)必须于加化学发光底物液后的第5～20分钟内测量，在化学发光测量仪上测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。

尽管已经示出和描述了本实用新型的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本实用新型的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本实用新型的范围由所附权利要求及其等同物限定。