来自样品的靶的尺寸排阻层析分离或脱盐中的并行分离和清洗的制作方法

本发明涉及层析，并且更特别地涉及用于在同时地执行包括多个柱的层析系统中的一个或多个层析柱的清洗的同时执行层析的方法和系统。更具体地，本发明涉及模拟移动床层析系统中的柱在其执行尺寸排阻层析(sec)或脱盐的同时进行的并行清洗。

背景技术：

尺寸排阻层析(sec)在分子穿过柱中的sec介质时根据尺寸差异而使分子分离。sec介质由带有化学及物理稳定性和惰性(即，缺乏反应性和吸附性质)的球形颗粒的多孔基体构成。为了执行分离，介质被装填到柱中，以形成装填床。装填床利用缓冲液来平衡，缓冲液填充基体的孔隙和位于颗粒之间的空间。固定相或位于孔隙的内侧的液体与流动相或位于颗粒的外侧的液体平衡。小分子进入介质的孔隙并且被延迟，而太大而不能进入介质的大分子无障碍地穿过柱。在图2b)中显示了典型的sec运行的结果的示例，其中，高分子量分子最先离开sec柱，并且，低分子量分子最后离开柱。因而，与离子交换或亲和层析不同，分子未结合到层析介质，因此，缓冲液成分未直接地对分辨率(离开柱的分子的峰之间的分离度)造成影响。因此，sec的显著优点是，条件可变化，以在不改变分离的情况下适应样品类型或对于进一步纯化、分析或存储的需求。柱越长，分辨率就越好，这是因为随着柱的长度增加，较小的分子被延迟达延长的较长的时间，然而，柱具有较大的背压，并且，存在针对柱可为多长的实际限制。被称为模拟移动床(smb)的方法用于克服该问题，这通过将期望的总长度的柱分成串联连接的多个柱而实现。压降由此减小到在带有与多个柱相同的总长度的单个柱上将经历的压降的部分。图1a)和图1b)显示了包括具有长度l的一个长柱1的系统(在图1a)中显示)上的压降dp与包括具有与单个柱相同的总长度和体积的三个相同的柱a、b、c的系统(在图1b)中显示)上的压降之间的理论比较。流体被供应到柱1(相应地，柱a)的顶部，并且从柱1(相应地，柱3)的底部提取流体。所提取的流体穿过检测器d，并且然后穿过阀，阀可将流体引导至废物通路w或存储部s。阀由检测器d控制-当检测器d检测到存在靶分子时，阀可被控制成在适当时将流体递送到废物部或存储部。如可清楚地看到的，柱a、柱b、柱c的总长度与柱1的长度相同，三个柱a-c中的各个上的理论压降仅为单个柱1上的理论压降的三分之一。然而，由于在任何时间仅两个柱需要串联连接(例如，如实线所显示的柱a和柱b以及如虚线所显示的柱b和柱c)，于是，层析运行期间的实际压降为2/3dp。

样品通常均衡地洗脱，因此，在分离期间不需要使用不同的缓冲液。然而，在分离结束时一般包括使用运行缓冲液或碱性溶液的清洗步骤(也被称为原地清洗(cip))，以移除可能已保留于柱上的分子并且为新运行准备柱。这样的清洗步骤耗费时间，这是因为分离介质需要经受清洗流体达一定的时长(例如，10分钟)，并且，柱不可使用，直到清洗步骤完成为止。

技术实现要素：

在一个方面，本发明涉及一种层析系统，该层析系统包括用于在根据本发明的方法中使用的多个基本上相同地装填的尺寸排阻层析柱。

在另一方面，本发明提供了一种操作尺寸排阻层析系统的方法，在该方法中，分离可与清洗步骤并行地进行。

附图说明

图1a)示意性地显示了单个柱。

图1b)示意性地显示了包括带有与图1a)中的柱相同的总长度的串联布置的多个柱的系统。

图2a)显示了带有280nm的波长的uv光的吸收度随针对sec柱中的sec运行的时间而变化的典型的图表，相应地显示了传导率随针对脱盐柱中的脱盐运行的时间而变化的典型的图表。

图2b)显示了吸收率随穿过sec柱的柱体积而变化的典型的图表。

图3a)示意性地显示了根据本发明的sec或脱盐系统的示例。

图3b)显示了图3a)的多位置阀的示意性放大图。

图4-7显示了根据本发明的包括使用图3的系统的多个循环的方法中的步骤。

图8-11显示了根据本发明的包括使用图3的系统的多个循环的另一方法中的步骤。

具体实施方式

本发明涉及一种使用尺寸排阻层析在包括多个容纳sec介质的柱的模拟移动床层析系统(smb系统)中使至少一个靶分子或成组的靶分子(在下文中，为了简洁起见，其被简称为“靶”)从样品中分离的方法，在该方法中，在分离过程期间，清洗该系统中的至少一个容纳介质的柱。

图3中示意性地显示了这样的系统的一个实施例。在此实施例中，系统30包括四个层析柱a、b、c、d。各个柱容纳分离介质(33)。优选地，柱具有基本上相同的性能，并且优选地，在每个柱中使用相同的分离介质和装填协议。具有基本上相同的柱确保层析循环的结果独立于使用柱所按照的顺序。各个柱遵循惯例，并且在一个端部处具有入口ai、bi、ci、di且在相反的端部处具有出口ao、bo、co、do。该系统包括多位置阀组件35，多位置阀组件35包括多个端口p1、p2…、pm，其中的各个可通过流体管路而连接到该系统中的其它构件中的一个。柱的各个入口和出口能够通过流体管路而连接到多位置阀35的单独的一个端口。阀35可布置成使任何柱的出口连接到任何其它柱的入口(例如，使柱a的出口ao连接到柱b的入口bi)。以此方式，任何柱中的流体可连续地转移到任何其它柱。阀进一步布置成使得可将缓冲液同时地提供给其它柱中的两个或更多个的入口，并且，将清洗流体提供给剩余的柱的入口。这可通过例如阀35而实现，阀35具有带有内部通道的转子，该转子可在定子中旋转，以提供阀的端口之间的所需的连接。

该系统设有包含靶41的样品或其它流体39(在下文中，为了简洁起见，其被称为“样品”)以及注射器或容器和泵或重力供给式管路42或用于将样品供给到流体管路或通向阀的样品引入端口‘p样品’的其它入口的其它部件。

该系统进一步包括：缓冲液流体43的源，其能够连接到阀的缓冲液入口端口；清洗流体45(例如，氢氧化钠溶液)的源，其能够连接到阀的清洗流体入口端口；第一传感器线路，其包括第一传感器47a，第一传感器47a能够连接到阀的入口端口和检测器出口端口；第二传感器线路，其包括第二传感器47b，第二传感器47b能够连接到阀的入口端口和检测器出口端口。传感器47a、47b可为任何类型的适当的传感器，例如对于检测蛋白质而言，传感器47a、47b可为对一个uv光波长或优选地两个或更多个uv光波长敏感的uv吸收检测器。这样的uv检测器在本领域中为众所周知的，并且检测蛋白质对穿过流体的uv光的吸收。在将出于其它目的(例如，脱盐)而使用该系统的情况下，传感器可为呈本领域中众所周知的类型的传导率传感器。提供泵49a、49b或其它流体驱动手段(例如，重力)，以使缓冲液流体和清洗流体能够流动到多位置阀35的相应的端口。多位置阀35进一步设有通向废物通路w的一个出口端口和通向靶收集器皿s或通路的另外的出口。提供诸如计算机、微处理器、带有适当的软件的控制电路或人工地操作的控制部件51的控制部件51，以控制多位置阀和泵，以便实现期望的通过该系统的样品流。将认识到，图3b)中所显示的系统示意性地示出了多种构件，这些构件单独地为已知的，因此，这些构件的构造的详细描述未被包括在本文中。此外，将提供可接受的性能的备选的构件对于技术人员而言将为显而易见的。例如，多位置阀35的使用为优选的，这是因为该阀组件提供紧凑型阀，但该多位置阀可由单独地开/关、打开/关闭的类型的阀的阵列替代，例如以在该系统将被制造为一次性硬件的情况下提供总体上成本较低的阀组件。在此情况下，可使用简单的流体压力启动式薄膜阀，或可采用螺线管操作式阀，所有这些阀都带有与本文中所描述的多位置阀同等的效果。这样的备选的阀阵列将由控制部件51控制，使得阀按照正确的顺序打开和关闭，以提供下文中所描述的期望的(一个或多个)流路。

为了实现靶的良好的分辨率并且使层析系统的利用增加到最大限度，提供了包括根据下文中所描述的步骤的至少一个分离循环的方法，该方法可人工地执行或通过使用控制部件以及适当的软件和硬件来控制(一个或多个)泵和(一个或多个)阀而执行。该方法旨在确保当柱用于多个循环时，各个柱经受大致相同的磨损(即，各个柱被同等地利用)，并且，该方法旨在确保在清洗步骤期间，各个柱中的介质暴露于清洗流体达足以确保充分清洗的时长。这通过在靶流动于两个其它的柱中和/或流动于两个其它的柱之间的同时将清洗流体提供给至少一个柱而实现。通过研究由定位于使来自第一柱的出口连接到第二柱的入口的流体管路中的传感器产生的信号而开始柱之间的流动的切换。当信号指示靶已离开第一柱并且已过去足以使靶进入第二柱的时间时，启动多位置阀，以使第二柱的入口连接到缓冲液的源，并且使第二柱的出口连接到该系列中的第三柱的入口。这使得靶穿过第二柱并且进入到第三柱中。同时，清洗缓冲液可经由第一柱的入口来输入到第一柱中，而第一柱的出口连接到废物部。这提供如下的优点：已在柱中延迟的不合期望的较小的分子被直接地发送到废物部而不穿过任何随后的柱，由此减小这些柱上的负载。在该方法的一个示例中，可在包括使样品连续地穿过多个柱中的除了一个之外的全部(例如，四个柱中的三个)的循环中使靶分离。

该方法可适应于基本上持续的使用，使得来自初始地装载到第一柱上的一个样品的靶一被分离并且收集，该系统就准备好将新样品装载到与初始接收先前的样品的先前的柱不同的柱上。优选地，样品的装载布置成使得在第一柱重新开始装载样品之前，各个柱依次初始地接收样品。这意味着柱经受大致相同的磨损。

在图4至图7中示出了用于用以使靶从样品中分离的尺寸排阻层析的方法的示例，其中，可在一系列的循环中装载样品，其中，各个系列包括四个循环，并且，在各个循环中，样品被装载到不同的柱上。各个循环包括三个步骤。

图4a)显示了第一循环的第一步骤中的四个柱的初始状态和最终状态。在第一循环的第一步骤的初始状态下，如在图4a)中的左边显示的，柱a和柱d以缓冲液填充，并且，柱b和柱c以清洗流体(例如，naoh)填充。多位置阀布置成使得柱a、柱c以及柱d的入口连接到缓冲液流，柱a的出口经由uv检测器来连接到柱b的入口，并且，柱b、柱c以及柱d的出口连接到废物部。通过将样品注射到进入柱a的入口的缓冲液流中而开始该第一步骤。这使得样品行进通过柱a。检测器监测离开柱a的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱b的信号时，第一循环的第一步骤完成。这在图4a)的右边的终结状态下显示。然后调整多位置阀，使得第一循环的第二步骤可开始。

在第一循环的第二步骤的初始状态下，如在图4b)中的左边显示的，所有的柱都以缓冲液填充。多位置阀布置成使得柱a和柱b的入口连接到缓冲液流，柱d的入口连接到清洗流体流，柱b的出口经由uv检测器来连接到柱c的入口，并且，柱a、柱c以及柱d的出口连接到废物部。该第二步骤开始，并且，进入柱b的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱b并且行进到柱c中。检测器监测离开柱b的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱c的信号时，第一循环的第二步骤完成。这在图4b)的右边的终结状态下显示。然后调整多位置阀，使得第一循环的第三步骤可开始。

在第一循环的第三并且最终的步骤的初始状态下，如在图4c)中的左边显示的，柱a、柱b以及柱c以缓冲液填充，而柱d以清洗流体填充。多位置阀布置成使得柱c和柱d的入口连接到缓冲液流，柱b的入口连接到清洗流体流，柱d的出口经由uv检测器来连接到柱a的入口，柱a和柱b的出口连接到废物部，而柱c的出口经由第二检测器来连接到可将离开柱c的流体引导至废物部或用于收集靶的容器的出口阀(未显示)。初始地，该出口阀将离开柱c的流体引导至废物部。该第三步骤开始，并且，进入柱c的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱c。一旦第二检测器检测到在离开柱c的流体中存在靶分子，出口阀就被操作成将流引导至用于收集靶的容器，并且，靶被收集。一旦靶已被收集(步骤3)，第一循环的第三步骤就完成。这在图4c)的右边的终结状态下显示。

如果将在该系统上进行进一步分离，则第二循环可开始。该循环的步骤在图5a)至图5c)中显示。

图5a)显示了第二循环的第一步骤中的四个柱的初始状态和最终状态。在第二循环的第一步骤的初始状态下，如在图5a)中的左边显示的，柱c和柱d以缓冲液填充，并且，柱a和柱b以清洗流体填充。多位置阀布置成使得柱b、柱c以及柱d的入口连接到缓冲液流，柱d的出口经由uv检测器来连接到柱a的入口，并且，柱a、柱b以及柱c的出口连接到废物部。通过将样品注射到进入柱d的入口的缓冲液流中而开始该第一步骤。这使得样品行进通过柱d。检测器监测离开柱d的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱a的信号时，第一循环的第一步骤完成。这在图5a)的右边的终结状态下显示。然后调整多位置阀，使得第二循环的第二步骤可开始。

在第二循环的第二步骤的初始状态下，如在图5b)中的左边显示的，所有的柱都以缓冲液填充。多位置阀布置成使得柱a和柱d的入口连接到缓冲液流，柱c的入口连接到清洗流体流，柱a的出口经由uv检测器来连接到柱b的入口，并且，柱b、柱c以及柱d的出口连接到废物部。该第二步骤开始，并且，进入柱a的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱a并且行进到柱b中。检测器监测离开柱a的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱b的信号时，第二循环的第二步骤完成。这在图5b)的右边的终结状态下显示。然后调整多位置阀，使得第二循环的第三步骤可开始。

在第二循环的第三并且最终的步骤的初始状态下，如在图5c)中的左边显示的，柱a、柱b以及柱d以缓冲液填充，而柱c以清洗流体填充。多位置阀布置成使得柱b和柱c的入口连接到缓冲液流，柱a的入口连接到清洗流体流，柱c的出口经由uv检测器来连接到柱d的入口，柱a和柱d的出口连接到废物部，而柱b的出口经由第二检测器来连接到可将离开柱b的流体引导至废物部或用于收集靶的容器的出口阀(未显示)。初始地，该出口阀将离开柱b的流体引导至废物部。该第三步骤开始，并且，进入柱b的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱b。一旦第二检测器检测到在离开柱b的流体中存在靶分子，出口阀就被操作成将流引导至用于收集靶的容器，并且，靶被收集。一旦靶已被收集(步骤3)，第二循环的第三步骤就完成。这在图5c)的右边的终结状态下显示。

如果将在该系统上进行进一步分离，则第三循环可开始。该循环的步骤在图6a)至图6c)中显示。

图6a)显示了第三循环的第一步骤中的四个柱的初始状态和最终状态。在第三循环的第一步骤的初始状态下，如在图6a)中的左边显示的，柱b和柱d以缓冲液填充，并且，柱a和柱d以清洗流体填充。多位置阀布置成使得柱a、柱b以及柱c的入口连接到缓冲液流，柱c的出口经由uv检测器来连接到柱d的入口，并且，柱a、柱b以及柱d的出口连接到废物部。通过将样品注射到进入柱c的入口的缓冲液流中而开始该第一步骤。这使得样品行进通过柱c。检测器监测离开柱c的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱d的信号时，第一循环的第一步骤完成。这在图6a)的右边的终结状态下显示。然后调整多位置阀，使得第三循环的第二步骤可开始。

在第三循环的第二步骤的初始状态下，如在图6b)中的左边显示的，所有的柱都以缓冲液填充。多位置阀布置成使得柱c和柱d的入口连接到缓冲液流，柱b的入口连接到清洗流体流，柱d的出口经由uv检测器来连接到柱a的入口，并且，柱a、柱b以及柱c的出口连接到废物部。该第二步骤开始，并且，进入柱d的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱d并且行进到柱a中。检测器监测离开柱d的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱a的信号时，第三循环的第二步骤完成。这在图6b)的右边的终结状态下显示。然后调整多位置阀，使得第三循环的第三步骤可开始。

在第三循环的第三并且最终的步骤的初始状态下，如在图6c)中的左边显示的，柱a、柱c以及柱d以缓冲液填充，而柱b以清洗流体填充。多位置阀布置成使得柱a和柱b的入口连接到缓冲液流，柱d的入口连接到清洗流体流，柱b的出口经由uv检测器来连接到柱c的入口，柱c和柱d的出口连接到废物部，而柱a的出口经由第二检测器来连接到可将离开柱a的流体引导至废物部或用于收集靶的容器的出口阀(未显示)。初始地，该出口阀将离开柱a的流体引导至废物部。该第三步骤开始，并且，进入柱a的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱a。一旦第二检测器检测到在离开柱a的流体中存在靶分子，出口阀就被操作成将流引导至用于收集靶的容器，并且，靶被收集。一旦靶已被收集(步骤3)，第三循环的第三步骤就完成。这在图6c)的右边的终结状态下显示。

如果将在该系统上进行进一步分离，则第四循环可开始。该循环的步骤在图7a)至图7c)中显示。

图7a)显示了第四循环的第一步骤中的四个柱的初始状态和最终状态。在第四循环的第一步骤的初始状态下，如在图7a)中的左边显示的，柱a和柱b以缓冲液填充，并且，柱c和柱d以清洗流体填充。多位置阀布置成使得柱a、柱b以及柱d的入口连接到缓冲液流，柱b的出口经由uv检测器来连接到柱c的入口，并且，柱a、柱c以及柱d的出口连接到废物部。通过将样品注射到进入柱b的入口的缓冲液流中而开始该第一步骤。这使得样品行进通过柱b。检测器监测离开柱b的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱c的信号时，第一循环的第一步骤完成。这在图7a)的右边的终结状态下显示。然后调整多位置阀，使得第四循环的第二步骤可开始。

在第四循环的第二步骤的初始状态下，如在图7b)中的左边显示的，所有的柱都以缓冲液填充。多位置阀布置成使得柱b和柱c的入口连接到缓冲液流，柱a的入口连接到清洗流体流，柱c的出口经由uv检测器来连接到柱d的入口，并且，柱a、柱b以及柱d的出口连接到废物部。该第二步骤开始，并且，进入柱c的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱c并且行进到柱d中。检测器监测离开柱c的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱d的信号时，第四循环的第二步骤完成。这在图7b)的右边的终结状态下显示。然后调整多位置阀，使得第四循环的第三步骤可开始。

在第四循环的的第三并且最终的步骤的初始状态下，如在图7c)中的左边显示的，柱b、柱c以及柱d以缓冲液填充，而柱a以清洗流体填充。多位置阀布置成使得柱a和柱d的入口连接到缓冲液流，柱c的入口连接到清洗流体流，柱a的出口经由uv检测器来连接到柱b的入口，柱b和柱c的出口连接到废物部，而柱d的出口经由第二检测器来连接到可将离开柱d的流体引导至废物部或用于收集靶的容器的出口阀(未显示)。初始地，该出口阀将离开柱d的流体引导至废物部。该第三步骤开始，并且，进入柱d的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱d。一旦第二检测器检测到在离开柱d的流体中存在靶分子，出口阀就被操作成将流引导至用于收集靶的容器，并且，靶被收集。一旦靶已被收集(步骤3)，第四循环的第三步骤就完成。这在图7c)的右边的终结状态下显示。

在四个循环期间，各个柱已针对样品的初始注射而使用一次，并且已针对靶的最终分级而使用一次。因而，各个柱上的负载已基本上同等。

如果将在该系统上进行进一步分离，则新的一系列的循环可开始。由于柱在第四循环的终结状态下的内含物(即，柱a和柱d中的缓冲液以及柱b和柱c中的清洗流体)与柱在第一循环的初始状态下的内含物相同，因而新的一系列的循环优选地遵循与先前的一系列的循环相同的顺序。

在使用四个层析柱(其中的三个将在分离循环中暴露于靶)的根据本发明的一般方法中，在循环中的第一步骤中，包含将与样品中的其它分子分离的靶(例如，蛋白质)的样品被装载于四个柱中的第一柱中，并且随后被输送到清洁的第二柱，而利用缓冲液来冲洗第三柱和第四柱。

一旦靶已在第一柱与第二柱之间的流体管路中被检测到并且已进入第二柱，循环的第二步骤就开始：多位置阀被操作成使得第二柱串联连接到第三柱，并且，靶被输送到第三柱，而利用缓冲液来冲洗第一柱，并且，利用清洗溶液来清洁第四柱。

一旦靶已在第二柱与第三柱之间的流体管路中被检测到并且已进入第三柱，循环中的第三步骤就开始：阀被操作成使得第四柱串联连接到第一柱，并且，来自柱4的清洗流体被供给到第一柱中，而靶分子通过第三柱而被输送。清洗流体还被供给到第二柱中。初始地，第三柱的出口经由传感器来连接到废物部。一旦传感器检测到靶，来自传感器的输出就被切换到靶收集器皿，并且，靶被收集于此处。同时，利用来自第四柱的清洗溶液来清洁第一柱，而利用缓冲液来冲洗第三柱和第四柱。

当将执行进一步分离时，则通过将样品注射到在清洗步骤之后已经以缓冲液填充的最后一个柱中而开始每一次分离。

在根据本发明的方法的第二示例中，可在包括使样品连续地穿过多个柱中的全部(例如，四个柱中的四个)的循环中使靶分离。

在图8至图11中示出了用于用以使靶从样品中分离的尺寸排阻层析的方法的示例，在该方法中，可在一系列的循环中装载样品，其中，各个系列包括四个循环，并且，在各个循环中，样品被装载到不同的柱上。各个循环使用柱中的全部四个来实现高分辨率，并且，各个循环包括四个步骤。

图8a)显示了第一循环的第一步骤中的四个柱的初始状态和最终状态。在第一循环的第一步骤的初始状态下，如在图8a)中的左边显示的，柱a和柱d以缓冲液填充，并且，柱c以清洗流体(例如，naoh)填充，并且，柱b利用来自柱a的缓冲液来冲洗以移除清洗流体。多位置阀布置成使得柱a和柱d的入口连接到缓冲液流，柱c的入口连接到清洗流体流，柱a的出口经由uv检测器来连接到柱b的入口，并且，柱b、柱c以及柱d的出口连接到废物部。通过将样品注射到进入柱a的入口的缓冲液流中而开始该第一步骤。这使得样品行进通过柱a。检测器监测离开柱a的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱b的信号时，第一循环的第一步骤完成。这在图8a)的右边的终结状态下显示，其中，柱c现在基本上以清洗流体填充。然后调整多位置阀，使得第一循环的第二步骤可开始。

在第一循环的第二步骤的初始状态之后不久，如在图8b)中的左边显示的，柱a和柱b以缓冲液填充，柱d已开始以清洗流体填充，并且，柱c已开始将清洗流体排空。因而，多位置阀布置成使得柱a和柱b的入口连接到缓冲液流，柱d的入口连接到清洗流体流，柱b的出口经由uv检测器来连接到柱c的入口，并且，柱a、柱c以及柱d的出口连接到废物部。随着该第二步骤继续进行，进入柱b的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱b并且行进到柱c中。检测器监测离开柱b的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱c的信号时，第一循环的第二步骤完成。这在图8b)的右边的终结状态下显示，其中，柱c现在基本上以清洗流体填充。然后调整多位置阀，使得第一循环的第三步骤可开始。

在第一循环的第三步骤的初始状态之后不久，如在图8c)中的左边显示的，柱a和柱c以缓冲液填充，柱b已开始以清洗流体填充，而以清洗流体填充的柱d利用来自柱c的内含物来冲洗。多位置阀布置成使得柱a和柱c的入口连接到缓冲液流，柱b的入口连接到清洗流体流，柱c的出口经由uv检测器来连接到柱d的入口，柱a、柱b以及柱d的出口连接到废物部。检测器监测离开柱c的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱d的信号时，第一循环的第三步骤完成。这在图8c)的右边的终结状态下显示，其中，柱b现在基本上以清洗流体填充。然后调整多位置阀，使得第一循环的第四步骤可开始。

在第一循环的第四步骤的初始状态之后不久，如在图8d)中的左边显示的，柱a和柱d以缓冲液填充，而以清洗流体填充的柱b利用缓冲液来冲洗，并且，柱c以清洗流体填充。多位置阀布置成使得柱a和柱d的入口连接到缓冲液流，柱c的入口连接到清洗流体流，柱a的出口经由uv检测器来连接到柱b的入口，柱b和柱c的出口连接到废物部。然而，柱d的出口经由第二检测器来连接到可将离开柱d的流体引导至废物部或用于收集靶的容器的出口阀(未显示)。初始地，该出口阀将离开柱d的流体引导至废物部。一旦该步骤开始，进入柱d的入口的缓冲液流就使得靶行进通过柱d。一旦第二检测器检测到在离开柱d的流体中存在靶分子，出口阀就被操作成将流引导至用于收集靶的容器，并且，靶被收集。一旦靶已被收集，第一循环的第四步骤就完成。这在图8d)的右边的终结状态下显示，其中，柱c现在基本上以清洗流体填充。

如果将在该系统上进行进一步分离，则第二循环可开始。该循环的步骤在图9a)至图9d)中显示。

图9a)显示了第二循环的第一步骤中的四个柱的初始状态和最终状态。多位置阀布置成使得柱a和柱b的入口连接到缓冲液流，柱d连接到清洗流体流，柱b的出口经由uv检测器来连接到柱c的入口，并且，柱a、柱c以及柱d的出口连接到废物部。在开始第二循环的第一步骤之后，如在图9a)中的左边显示的，柱a和柱b以缓冲液填充，充满缓冲液的柱d以清洗流体填充，并且，以清洗流体填充的柱c以缓冲液填充。通过将样品注射到进入柱b的入口的缓冲液流中而开始该第一步骤。这使得样品行进通过柱b。检测器监测离开柱b的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱c的信号时，第一循环的第一步骤完成。这在图9a)的右边的终结状态下显示。柱a、柱b以及柱c容纳缓冲液，并且，柱d容纳清洗流体。然后调整多位置阀，使得第二循环的第二步骤可开始。

在图9b)中所显示的第二循环的第二步骤中，多位置阀布置成使得柱b和柱c的入口连接到缓冲液流，柱a的入口连接到清洗流体流，柱c的出口经由uv检测器来连接到柱d的入口，并且，柱a、柱b以及柱d的出口连接到废物部。该第二步骤开始，并且，进入柱c的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱c并且行进到柱d中。在第二循环的第二步骤已开始之后，如在图9b)中的左边显示的，柱b和柱c以缓冲液填充，柱d由清洗流体冲洗，并且，柱a以清洗流体填充。检测器监测离开柱c的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱d的信号时，第二循环的第二步骤完成。这在图9b)的右边的终结状态下显示。柱b、柱c以及柱d容纳缓冲液，并且，柱a容纳清洗流体。然后调整多位置阀，使得第二循环的第三步骤可开始。

在第二循环的第三步骤中，如图9c)中所显示的，多位置阀布置成使得柱b和柱d的入口连接到缓冲液流，柱c的入口连接到清洗流体流，柱d的出口经由uv检测器来连接到柱a的入口，柱a、柱b以及柱c的出口连接到废物部。在该步骤开始时，柱b、柱c以及柱d以缓冲液填充，而柱c以清洗流体填充。如在图9c)中的左边显示的，一旦该第三步骤开始，进入柱d的入口的缓冲液流就使得靶行进通过柱d。检测器监测离开柱d的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱a的信号时，第二循环的第三步骤完成。这在图9c)的右边的终结状态下显示。柱a、柱b以及柱d容纳缓冲液，柱c容纳清洗流体，并且，靶位于柱a中。然后调整多位置阀，使得第二循环的第四步骤可开始。

在第二循环的第四步骤中，如图9d)中所显示的，多位置阀布置成使得柱a和柱b的入口连接到缓冲液流，柱d的入口连接到清洗流体流，柱b的出口经由uv检测器来连接到柱c的入口，柱b和柱d的出口连接到废物部，并且，柱b的出口经由第二检测器来连接到可将离开柱b的流体引导至废物部或用于收集靶的容器的出口阀(未显示)。初始地，该出口阀将离开柱b的流体引导至废物部。一旦该步骤开始，进入柱b的入口的缓冲液流就使得靶行进通过柱b。一旦第二检测器检测到在离开柱b的流体中存在靶分子，出口阀就被操作成将流引导至用于收集靶的容器，并且，靶被收集。一旦靶已被收集，第一循环的第四步骤就完成。在该步骤开始时，柱a、柱b以及柱d以缓冲液填充，而柱c以清洗流体填充。如在图9d)中的左边显示的，一旦该第四步骤已开始，进入柱a的入口的缓冲液流就使得靶行进通过柱a。一旦第二检测器检测到在离开柱a的流体中存在靶分子，出口阀就被操作成将流引导至用于收集靶的容器，并且，靶被收集。一旦靶已被收集，第二循环的第四步骤就完成。这在图9d的右边的终结状态下显示，其中，柱a、柱b以及柱c容纳缓冲液，并且，柱d容纳清洗流体。

如果将在该系统上进行进一步分离，则第三循环可开始。该循环的步骤在图10a)至图10c)中显示。图10a)显示了第三循环的第一步骤中的四个柱的中间状态和最终状态。多位置阀布置成使得柱b和柱c的入口连接到缓冲液流，柱a连接到清洗流体流，柱c的出口经由uv检测器来连接到柱d的入口，并且，柱a、柱b以及柱d的出口连接到废物部。在开始第三循环的第一步骤之后，如在图10a)中的左边显示的，柱b和柱c以缓冲液填充，充满缓冲液的柱a以清洗流体填充，并且，以清洗流体填充的柱d以缓冲液填充。通过将样品注射到进入柱c的入口的缓冲液流中而开始该第一步骤。这使得样品行进通过柱c。检测器监测离开柱c的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱d的信号时，第一循环的第一步骤完成。这在图10a)的右边的终结状态下显示。柱b、柱c以及柱d容纳缓冲液，并且，柱a容纳清洗流体。然后调整多位置阀，使得第三循环的第二步骤可开始。

在第三循环的第二步骤中，多位置阀布置成使得柱c和柱d的入口连接到缓冲液流，柱b的入口连接到清洗流体流，柱d的出口经由uv检测器来连接到柱a的入口，并且，柱a、柱b以及柱c的出口连接到废物部。该第二步骤开始，并且，进入柱d的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱d并且行进到柱a中。在第三循环的第二步骤已开始之后，如在图10b)中的左边显示的，柱c和柱d以缓冲液填充，并且，柱b以清洗流体填充。检测器监测离开柱d的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱a的信号时，第三循环的第二步骤完成。这在图10b)的右边的终结状态下显示，其中，柱b由清洗流体填充，其它柱容纳缓冲液，并且，靶位于柱a中。然后调整多位置阀，使得第三循环的第三步骤可开始。

在第三循环的第三步骤中，如图10c)中所显示的，多位置阀布置成使得柱a和柱c的入口连接到缓冲液流，柱d的入口连接到清洗流体流，柱a的出口经由uv检测器来连接到柱b的入口，柱b、柱c以及柱d的出口连接到废物部。在该步骤开始时，柱a、柱c以及柱d以缓冲液填充，而柱b以清洗流体填充。如在图10c)中的左边显示的，一旦该第三步骤开始，进入柱a的入口的缓冲液流就使得靶行进通过柱a。检测器监测离开柱a的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱b的信号时，第三循环的第三步骤完成。柱的针对第四步骤的开始状态在图10c)的右边的终结状态下显示，其中靶位于柱b中。然后调整多位置阀，使得第三循环的第四步骤可开始。

在第四步骤开始时，柱a、柱b以及柱c以缓冲液填充，而柱d以清洗流体填充。在第三循环的第四步骤中，如图10d)中所显示的，多位置阀布置成使得柱b和柱c的入口连接到缓冲液流，柱a的入口连接到清洗流体流，柱c的出口经由uv检测器来连接到柱d的入口，柱a和柱d的出口连接到废物部，并且，柱b的出口经由第二检测器来连接到可将离开柱b的流体引导至废物部或用于收集靶的容器的出口阀(未显示)。初始地，该出口阀将离开柱b的流体引导至废物部。一旦该步骤开始，进入柱b的入口的缓冲液流就使得靶行进通过柱b。一旦第二检测器检测到在离开柱b的流体中存在靶分子，出口阀就被操作成将流引导至用于收集靶的容器，并且，靶被收集。一旦靶已被收集，第一循环的第四步骤就完成。这在图10d)的右边的终结状态下显示。

如果将在该系统上进行进一步分离，则第四循环可开始。该循环的步骤在图11a)至图11d)中显示。图11a)显示了第四循环的第一步骤中的四个柱的中间状态和最终状态。初始地，柱b、柱c以及柱d以缓冲液填充，并且，柱a以清洗流体填充。多位置阀布置成使得柱c和柱d的入口连接到缓冲液流，柱b连接到清洗流体流，柱d的出口经由uv检测器来连接到柱a的入口，并且，柱b、柱c以及柱d的出口连接到废物部。通过将样品注射到进入柱d的入口的缓冲液流中而开始该第一步骤。这使得样品行进通过柱d。在开始第三循环的第一步骤之后，如在图11a)中的左边显示的，柱c和柱d以缓冲液填充，充满清洗流体的柱a以缓冲液填充，并且，以缓冲液填充的柱b以清洗流体填充。检测器监测离开柱d的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱a的信号时，第一循环的第一步骤完成。这在图11a)的右边的终结状态下显示。柱a、柱c以及柱d容纳缓冲液，并且，柱b容纳清洗流体。靶位于柱a中。然后调整多位置阀，使得第四循环的第二步骤可开始。

在第二步骤中，多位置阀布置成使得柱a和柱d的入口连接到缓冲液流，柱c的入口连接到清洗流体流，柱a的出口经由uv检测器来连接到柱b的入口，并且，柱b、柱c以及柱d的出口连接到废物部。该第二步骤开始，并且，进入柱a的入口的缓冲液流使得靶行进通过柱a并且行进到柱b中。在第三循环的第二步骤已开始之后，如在图11b)中的左边显示的，柱a和柱d以缓冲液填充，并且，柱c以清洗流体填充。检测器监测离开柱a的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱b的信号时，第四循环的第二步骤完成。这在图11b)的右边的终结状态下显示，其中靶位于柱b中，缓冲液位于柱a和柱d中，并且，清洗流体位于柱c中。然后调整多位置阀，使得第四循环的第三步骤可开始。

在第四循环的第三步骤中，如图11c)中所显示的，多位置阀布置成使得柱b和柱d的入口连接到缓冲液流，柱a的入口连接到清洗流体流，柱b的出口经由uv检测器来连接到柱c的入口，柱b、柱c以及柱d的出口连接到废物部。在该步骤开始时，柱a、柱b以及柱d以缓冲液填充，而柱c以清洗流体填充。如在图11c)中的左边显示的，一旦该第三步骤开始，进入柱b的入口的缓冲液流就使得靶行进通过柱b。检测器监测离开柱b的流体，并且，当检测到指示靶已经过检测器并且已进入柱c的信号时，第四循环的第三步骤完成。柱的针对第四步骤的开始状态在图11c)的右边的终结状态下显示，其中，靶位于柱c中。然后调整多位置阀，使得第四循环的第四步骤可开始。

在第四步骤开始时，柱b、柱c以及柱d以缓冲液填充，而柱a以清洗流体填充。在第四循环的第四步骤中，如图11d)中所显示的，多位置阀布置成使得柱c和柱d的入口连接到缓冲液流，柱b的入口连接到清洗流体流，柱d的出口经由uv检测器来连接到柱a的入口，柱a和柱b的出口连接到废物部，并且，柱c的出口经由第二检测器来连接到可将离开柱c的流体引导至废物部或用于收集靶的容器的出口阀(未显示)。初始地，该出口阀将离开柱c的流体引导至废物部。一旦该步骤开始，进入柱c的入口的缓冲液流就使得靶行进通过柱c。一旦第二检测器检测到在离开柱c的流体中存在靶分子，出口阀就被操作成将流引导至用于收集靶的容器，并且，靶被收集。一旦靶已被收集，第四循环的第四步骤就完成。这在图11d)的右边的终结状态下显示。

如果将在该系统上进行进一步分离，则新的一系列的循环可开始。由于柱在第四循环的终结状态下的内含物(即，柱a、柱b以及柱c中的缓冲液和柱d中的清洗流体)与柱在第一循环的初始状态下的内含物相同，因而新的一系列的循环优选地遵循与先前的一系列的循环相同的顺序。

如果按照上文中所描述的顺序执行四个sec或脱盐循环，则各个柱已针对样品的初始注射而使用一次，并且，各个柱已针对靶的最终分级而使用一次。因而，各个柱上的负载已在四个循环内基本上为同等的。因而，在使用四个柱的各组四个循环中，在每次新循环开始时，各个柱的标号可被认为已在基数四中减小一，使得当开始下一个循环时，第二柱(即，柱b)被重新指定为第一柱(即，柱a)，第三柱(柱c)被重新指定为第二柱(柱b)，第四柱(柱d)被重新指定为第三柱(柱c)，并且，第一柱(柱a)被重新指定为第四柱(柱d)。

因而，当使用n个柱时，则在成组的n个循环中的各个随后的循环中，柱的标号在基数n中减小一。例如，在使用三个柱的系统中，n=3，并且，在第一循环结束时，柱1被重新指定为柱3，柱2被重新指定为柱1，并且，柱3被重新指定为柱2。

在具有三个柱(n=3)的系统中，有可能仅仅使用柱中的两个(n-1)以用于sec或脱盐，在此情况下，各个循环仅具有两个步骤，即在清洗第三柱的同时使样品穿过第一柱而到达第二柱的第一步骤，以及在利用缓冲液冲洗第三柱并且以来自第三柱的清洗流体填充第一柱的同时从第二柱收集靶的第二步骤。

在具有三个柱(n=3)的系统中，有可能使用柱中的全部三个(n)以用于sec或脱盐，在此情况下，各个循环具有三个步骤，即在清洗第三柱的同时使样品穿过第一柱而到达第二柱的第一步骤，在利用清洗流体冲洗第一柱的同时将靶从第二柱输送到第三柱的第二步骤，以及当以来自第一柱的清洗流体填充第二柱时从第三柱收集靶的第三步骤。新循环然后可从第一柱开始。然而，如果将使柱上的负载同等，则下一个循环应当以装载到第二柱上开始。优选地，为了降低靶与第二柱中的清洗流体接触的风险，样品的装载应当延迟，直到在缓冲液的柱体积的合适的部分(例如，20%或25%或50%或甚至更多)已进入第二柱之后为止。

为了使柱上的负载同等，只要对应地修正循环的步骤以便确保在来自进入柱的两个不同的样品的靶之间实现柱的清洗，当然就有可能通过使各个柱的标号增大或减小比n更小的任何数而改变柱的顺序。

一种根据本发明的用于在系统中执行来自样品的靶的尺寸排阻层析分离(sec)或脱盐的方法包括以下步骤：

i)为系统提供能够连接的至少三个柱(a、b、c、…)的步骤，例如，其中仅一对柱同时串联连接；

ii)使容纳靶的柱与另一柱串联连接的步骤，

ii)在通过缓冲液流而将靶从容纳靶的所述柱输送到所述另一柱的同时利用清洗流体来清洗至少一个另外的柱的步骤。

该方法的额外的步骤包括：使所述另一柱的出口连接到被清洗的另外的柱的入口，并且随后从被清洗的柱的出口收集靶。

该方法的备选的额外的步骤包括以下步骤：将靶从所述另一柱的出口按照任何顺序连续地输送通过所述被清洗的另外的柱和一个或多个额外的柱，并且最终从最后一个额外的柱或被清洗的另外的柱收集靶。

一种根据本发明的用于包括用于使靶从样品中分离的四个柱的尺寸排阻层析(sec)或脱盐系统的方法的示例，其中，靶在被收集之前穿过四个柱，

包括以下步骤：

a)i)将阀定位成使得第三柱的入口连接到清洗流体的源，第一柱的出口连接到第二柱的入口，第一柱的入口以及任选地第四柱的入口连接到所述第一缓冲液的源，并且，所述第二柱、所述第三柱以及所述第四柱的出口被引导至废物组件，

ii)将检测器布置于第一柱的出口与第二柱的入口之间，

iii)将包含所述靶物质的样品s注射到所述第一柱的入口中；

iv)随后，将清洗流体泵送到所述第三柱中，并且将第一缓冲液泵送到至少所述第一柱以及任选地所述第四柱的入口中，直到靶分子已经过所述检测器并且已进入第二柱为止；

b)i)将阀定位成使得所述第二柱的出口连接到所述第三柱的入口，第二柱的入口以及任选地所述第一柱的入口连接到所述第一缓冲液的源，第四柱的入口连接到清洗流体的源，

ii)将所述检测器布置于第二柱的出口与第三柱的入口之间，

iii)随后，将清洗流体泵送到所述第四柱中，而将第一缓冲液泵送到至少所述第二柱的入口中，直到靶分子已经过所述检测器并且已进入第三柱为止；

c)i)使所述第三柱的出口连接到所述第四柱的入口，第三柱的入口以及任选地所述第二柱的入口连接到所述第一缓冲液的源，第一柱的入口连接到清洗流体的源，

ii)将所述检测器布置于第三柱的出口与第四柱的入口之间，

iii)随后，将清洗流体泵送到所述第一柱中，而将第一缓冲液泵送到至少所述第三柱的入口中，直到靶分子已经过所述检测器并且已进入第四柱为止，

d)i)使所述第四柱的出口连接到阀部件，以用于使流体转向到废物组件或靶收集组件，所述第三柱的入口连接到清洗流体的源，所述第一柱的出口连接到所述第二柱的入口，并且，第二柱和第三柱的出口连接到废物组件；

ii)将所述第一检测器布置于所述第一柱的出口与所述第二柱的入口之间，并且将所述第二检测器布置于第四柱的出口与收集组件的入口之间，

iii)将清洗流体泵送到所述第三柱中，并且将第一缓冲液泵送到至少第四柱的入口中，直到靶分子已经过所述检测器并且已进入收集组件为止。

在根据本发明的方法的所有的示例中，如果确定样品的每次注射之间的清洗并非必要的(例如，有可能在清洗柱之前运行多个样品)，则该方法可设有清洗流体由缓冲液流体替代或实际上根本没有流体的步骤。

本公开的上文中的描述出于说明的目的而提供，并且，本领域技术人员将理解，在未改变本公开的概念和基本特征的情况下，可作出多种改变和修改。因而，清楚的是，上文中所描述的实施例在所有的方面都为说明性的，而并不限制本公开。

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