一种检测样液中加替沙星含量的方法与流程

本发明属于化学技术领域，特别涉及一种检测样液中加替沙星含量的方法。

背景技术：

加替沙星化学名为1-环丙基-6-氟-1,4-二氢-8-甲氧基-7-(3-甲基-1-哌嗪基)-4-氧代-3-喹啉羧酸，分子式为c19h22fn3o4，是第四代新型合成氟喹诺酮类抗菌剂，通过抑制细菌的dna旋转酶和拓扑异构酶iv，从而抑制细菌dna合成，起到快速杀菌的作用。在临床上主要应用于泌尿道感染、呼吸道感染、细菌性胃肠炎和革兰氏阴性菌引起的软组织感染。

虽然加替沙星具有良好的杀菌作用，但过量的加替沙星也会对人体造成危害，因此在日常生活中了解药物或饮用水等物品中加替沙星的含量很有必要。当前对加替沙星含量的测定主要采用结晶法、动力学方法等；但该类方法均存在操作繁琐、分离时间较长和适用性窄等问题。而且目前对加替沙星含量的检测对象主要集中在加替沙星片等药物中，针对水样的检测方法鲜有报道。

技术实现要素：

本发明意在提供一种检测样液中加替沙星含量的方法，以实现对水样中加替沙星的含量进行准确测定。

本方案中的一种检测样液中加替沙星含量的方法，包括以下步骤：

步骤一、加替沙星标准液的配制：将加替沙星标准品用碱性溶液溶解，并使用二次蒸馏水定容得到加替沙星标准液，冷藏备用；

步骤二、原料准备：选取3.0％～5.0％(m/v)的tritonx-114溶液、1.0％～3.0％(m/v)的sds溶液和20％～50％(m/v)的氯化钠溶液冷藏备用；

步骤三、样液处理：去除样液中的悬浮颗粒，然后将样液在避光条件下冷藏备用；

步骤四、制定加替沙星标准溶液的浊点萃取标准曲线:移取0.05～5ml的加替沙星标准溶液于15ml离心管中，依次加入1.0％～3.0％(m/v)的sds溶液0.5～5.0ml，3.0％～5.0％(m/v)的tritonx-114溶液0.1～1.0ml，20％～50％(m/v)的氯化钠溶液1.0～4.0ml得到混合液，混匀；待混合液中出现浑浊时，将混合液的ph值调节为1～6，用二次蒸馏水定容，摇匀，于室温下静置5.0～30.0min；然后以2000～8000rpm的转速离心5～10min，冷却使其自然分层，得到上层的水相和下层的富集相；冷却后反转离心管弃去上层水相，再用无水乙醇稀释下层富集相并定容至0.5～5ml，联用荧光分光光度计对其进行测定，确定加替沙星的激发波长和发射波长分别为295nm和480nm，得到加替沙星标准液的浊点萃取标准曲线；

步骤五、加替沙星样液中加替沙星的测定：移取0.05～5ml的加替沙星样液于15ml离心管中，依次加入1.0％～3.0％(m/v)的sds溶液0.5～5.0ml，3.0％～5.0％(m/v)的tritonx-114溶液0.1～1.0ml，20％～50％(m/v)的氯化钠溶液1.0～4.0ml得到混合液，混匀；待混合液中出现浑浊时，将混合液的ph值调节为1～6，用二次蒸馏水定容，摇匀，于室温下静置5.0～30.0min；然后以2000～8000rpm的转速离心5～10min，冷却使其自然分层，得到上层的水相和下层的富集相；冷却后反转离心管弃去上层水相，再用无水乙醇稀释下层富集相并定容至0.5～5ml，联用荧光分光光度计对其进行测定，确定加替沙星的激发波长和发射波长分别为295nm和480nm，得到加替沙星样液的荧光强度，结合加替沙星标准液的浊点萃取标准曲线，得到加替沙星样液中加替沙星的含量。

本方案的有益效果：本方案采用混合胶束—浊点萃取对加替沙星样液中残留的加替沙星进行富集，避免了传统液液萃取中有机溶剂的大量使用，方法安全、绿色、环保。另外，此方法还有很多优点：使用荧光分光光度法进行检测，仪器的检测限较低，灵敏度较高，适用于痕量物质的分析检测，能够实现对水样中残留加替沙星的快速、准确、高重现性、高回收率的测定，并且仪器价格相对低廉，操作简便快捷，对操作人员的技术素质要求较低，方法容易进行推广。加替沙星标准品是一般在98～100％含量的单品，在专门的药品备案的机构可直接购买。

进一步，步骤一中，所述碱性溶液为0.1～1.0mol/l的氢氧化钠溶液。采用0.1～1.0mol/l的氢氧化钠溶液作为溶剂，能更加快速的将加替沙星溶解，引入的溶剂量少且取材方便。

进一步，步骤四和步骤五中，混合液冷却使其自然分层，得到上层的水相和下层的富集相时，采用冰浴冷却5～10min。采用冰浴的方式进行冷却，有利于使混合液快速分层，减少冷却时间并提高取出上层水相的效率，保证检测精度。

进一步，步骤四和步骤五中，混合液的ph值调节时采用0.1～1.0mol/l的盐酸溶液。采用0.1～1.0mol/l的盐酸溶液调节ph值，能更加快速的调节混合液的ph值并使避免引入的酸性溶液破坏混合液中物质的结构。

进一步，步骤二中所述tritonx-114溶液的配制：取tritonx-114用二次蒸馏水溶解，定容得到浓度为3.0％～5.0％(m/v)的tritonx-114溶液。采用二次蒸馏水配置tritonx-114溶液，可以尽可能的减少杂质的引入，有利于减少变量，确保加替沙星的检测精度。tritonx-114为聚氧乙烯单叔辛基苯基醚。

进一步，步骤二中所述sds溶液的制备：取sds用二次蒸馏水溶解，定容得到浓度为1.0％～3.0％(m/v)的sds溶液。采用二次蒸馏水配置sds(十二烷基硫酸钠)溶液，可以尽可能的减少杂质的引入，有利于减少变量，确保加替沙星的检测精度。

进一步，步骤二中所述氯化钠溶液的制备：取氯化钠用二次蒸馏水溶解，定容得到浓度为20％～50％(m/v)的氯化钠溶液。采用二次蒸馏水配置氯化钠溶液，可以尽可能的减少杂质的引入，有利于减少变量，确保加替沙星的检测精度。

附图说明

图1为本发明实施例中不同表面活性剂对加替沙星浊点萃取的影响柱状图；

图2为本发明实施例中加替沙星浊点萃取前后的激发光谱图；

图3为本发明实施例中加替沙星浊点萃取前后的发射光谱图；

图4为本发明实施例中ph在1～14范围内对加替沙星浊点萃取的影响曲线图；

图5为本发明实施例中ph在1～4范围内对加替沙星浊点萃取的影响曲线图；

图6为本发明实施例中sds浓度对加替沙星浊点萃取的影响曲线图；

图7为本发明实施例中tritonx-114浓度对加替沙星浊点萃取的影响；

图8为本发明实施例中氯化钠浓度对加替沙星浊点萃取的影响曲线图；

图9为本发明实施例中平衡温度对加替沙星浊点萃取的影响曲线图；

图10为本发明实施例中平衡时间对加替沙星浊点萃取的影响曲线图；

图11为本发明实施例中加替沙星标准液浊点萃取后的标准曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

图2中a为加替沙星浊点萃取前的激发光谱图、b为加替沙星浊点萃取后的激发光谱图；

图3中a为加替沙星浊点萃取前的发射光谱图、b为加替沙星浊点萃取后的发射光谱图。

实施例：

本发明中用于检测加替沙星的方法可用于检测各种含加替沙星的溶液，尤其适用于对水体中的加替沙星含量进行检测，实施例选取水样作为加替沙星样液。

一种检测样液中加替沙星含量的方法，包括以下步骤：

步骤一、加替沙星标准液的配制：精密称取加替沙星标准品5.0mg于烧杯中，用少量0.1mol/l氢氧化钠溶液完全溶解后，用二次蒸馏水定容至50l的容量瓶中，浓度为100μg/ml，于4℃的冰箱保存备用；使用时用二次蒸馏水逐级稀释；

步骤二、tritonx-114溶液配制：精密称取2.50gtritonx-114于烧杯中，用适量二次蒸馏水溶解，定容到50ml的容量瓶中，浓度为50mg/ml，即5.0％(m/v)，4℃的冰箱保存备用；

步骤三、sds溶液的制备：精密称取sds固体2.00g于烧杯中，用适量二次蒸馏水溶解，定容到100ml的容量瓶中，浓度为20mg/ml，即2.0％(m/v)，4℃的冰箱保存备用；

步骤四、氯化钠溶液的制备：精密称取氯化钠固体30.00g于烧杯中，用适量二次蒸馏水溶解，定容到100ml的容量瓶中，浓度为0.3g/ml，即30.0％(m/v)，4℃的冰箱保存备用；

步骤五、水样的采集和预处理：湘江河水、仁江河水、校园池塘水、天鹅湖水和自来水水样均采集于遵义当地，采集后的水样经0.45μm滤膜过滤后，放置于棕色玻璃瓶中，4℃的冰箱保存备用。

步骤六、制定加替沙星标准溶液的浊点萃取标准曲线:移取2ml的加替沙星标准溶液于15ml离心管中，依次加入2.0％(m/v)的sds溶液2.5ml，5.0％(m/v)的tritonx-114溶液0.3ml，30.0％(m/v)的氯化钠溶液2ml得到混合液，混匀；待混合液中出现浑浊时，加入1mol/l的盐酸溶液至混合液ph值为2.0，用二次蒸馏水定容至10ml，摇匀，于室温下静置10min；然后以4000rpm的转速离心5min，离心后冰浴冷却5min；冷却后反转离心管弃去上层水相，再用无水乙醇稀释下层富集相并定容至3ml，联用荧光分光光度计对其进行测定，确定加替沙星的激发波长和发射波长分别为295nm和480nm，得到加替沙星标准液的浊点萃取标准曲线；

步骤七、加替沙星样液中加替沙星的测定：移取2ml的加替沙星样液于15ml离心管中，依次加入2.0％(m/v)的sds溶液2.5ml，5.0％(m/v)的tritonx-114溶液0.3ml，30.0％(m/v)的氯化钠溶液2ml得到混合液，混匀；待混合液中出现浑浊时，加入1mol/l的盐酸溶液至混合液ph值为2.0，用二次蒸馏水定容至10ml，摇匀，于室温下静置10min；然后以4000rpm的转速离心5min，离心后冰浴冷却5min；冷却后反转离心管弃去上层水相，再用无水乙醇稀释下层富集相并定容至3ml，联用荧光分光光度计对其进行测定，确定加替沙星的激发波长和发射波长分别为295nm和480nm，得到加替沙星样液的荧光强度，将加替沙星样液的荧光强度与加替沙星标准液的浊点萃取标准曲线进行比对，得到加替沙星样液中加替沙星的含量。

为了进一步验证本发明的技术方案，申请人进行了如下方案：

混合胶束—浊点萃取荧光分光光度法检测环境水样中加替沙星浊点萃取条件的选择。

非离子表面活性剂的选择

试验考察了tritonx-114、ponpe10、吐温-80、司班-80、聚氧乙烯氢化蓖麻油和辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯六种非离子表面活性剂对体系荧光强度的影响，结果表明：在相同条件下，选择tritonx-114作为非离子表面活性剂时，体系的荧光强度最大，结果见附图1。

激发和发射波长的选择：

按实验方法，在200-400nm范围内对激发波长进行光谱扫描，在400-600nm范围内对发射波长进行光谱扫描，绘制激发和发射光谱，见附图2和附图3。由附图2可知：加替沙星(曲线a)的最大激发波长为289.06nm，浊点萃取后加替沙星(曲线b)的最大激发波长发生红移至295nm，所以试验选择295nm作为检测的激发波长。由附图3可知：加替沙星(曲线a)的最大发射波长为480nm，浊点萃取后加替沙星(曲线b)的最大发射波长没有发生改变，仍为480nm，所以试验选择480nm作为检测的发射波长。

体系ph的选择

试验考察了体系ph在1～14范围内变化时对荧光强度的影响，结果表明：体系ph＝1～4时，荧光强度较大且差别不大，结果见附图4。因此，本研究又继续考察了体系ph＝1～4范围内变化时，ph对荧光强度的影响，结果表明：当体系的ph＝2.0时，荧光强度最大。因此，试验选用的体系ph值为2.0，结果见附图5。

sds浓度的选择

试验考察了sds浓度在0.1％～1％(m/v)浓度范围内变化时，对体系的荧光强度的影响，结果表明：当sds的浓度为0.5％(m/v)时，体系的荧光强度最大，之后随着sds浓度的增大，gat的荧光强度反而降低。因此，试验选择sds的浓度为0.5％(m/v)，结果见附图6。

tritonx-114浓度的选择

试验考察了tritonx-114浓度在0.05％～0.5％(m/v)浓度范围内变化时，对体系荧光强度的影响，结果表明：当tritonx-114浓度为0.15％(m/v)时，体系的荧光强度最大，之后随着tritonx-114浓度的增大，体系的荧光强度反而降低。因此，试验选择tritonx-114的浓度为0.15％(m/v)，结果见附图7。

nacl浓度的选择

试验考察了nacl浓度在3％～12％(m/v)浓度范围内变化时，对体系荧光强度的影响，结果表明：当nacl浓度为0.6％(m/v)时，体系的荧光强度最大，之后随着nacl浓度的增大，体系的荧光强度反而下降。因此，试验选择nacl的浓度为0.6％(m/v)，结果见附图8。

平衡温度的选择

试验考察了平衡温度在25℃～65℃范围内变化时，对体系荧光强度的影响，结果表明：不同平衡温度下的荧光强度变化不明显。因此，试验选择室温25℃作为浊点萃取的平衡温度，结果见附图9。

平衡时间的选择

试验考察了平衡时间在5min～30min范围内变化时，对体系荧光强度的影响，结果表明：平衡时间为10min时，体系的荧光强度最大，且30min内荧光强度无明显变化，试验选择平衡时间为10min，结果见附图10。

水样中加替沙星检测方法的方法学考察

线性关系考察

在最优反应条件下，对加替沙星标准液质量浓度为5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、150.0、200.0ng/ml的系列工作溶液进行测定，绘制体系的标准曲线，如图11所示，结果表明，加替沙星的质量浓度在5.0～200.0ng/ml范围内与荧光强度呈良好的线性关系，其线性回归方程为y＝1.54997c+6.97855，线性相关系数r＝0.9997。

检测限和定量限

基于响应值的标准偏差和标准曲线斜率法计算。按照lod＝3.3δ/s，loq＝10δ/s(δ是测定空白值的标准偏差，s是标准曲线的斜率)计算，得到其检测限和定量限为0.27和0.81ng/ml。

重复性

按本发明的实施例所述的测定方法制备6份加替沙星模拟样品，再按照步骤4)进行检测，计算rsd＝0.84％，(n＝6)，说明该方法的重复性良好。

稳定性

按本发明的实施例所述的测定方法对加替沙星模拟样品，分别在0、2、4、6、8、10、12h按照步骤4)进行检测，计算rsd＝0.53％，说明该方法的稳定性良好。

日间精密度

按本发明的实施例所述的测定方法对加替沙星模拟样品，按照步骤4)连续测定3天，计算rsd＝0.83％，说明该方法的日间精密度良好。

干扰物影响

在本发明的最佳条件下，考察了常见辅料以及样品中可能存在的干扰物对浊点萃取的影响，确定了这些物质无干扰时的最大存在倍数，结果见表1。当加替沙星浓度为0.20ug/ml，相对误差在±5％范围内，ca2+、k+、mg2+、zn2+、so42-、po43-等大量存在也不会对测定有影响。

表1共存物质对浊点萃取的影响

样品含量测定

取自遵义当地5种水样样品，在本发明的最佳条件下进行检测，5种水样中均未检测出加替沙星的残留。

回收率实验

向5种水样中分别加入低、中、高3种浓度不同的加替沙星标准溶液，在本发明的最佳条件下进行回收试验，结果见表2。由表2可知，本法的灵敏度和准确度较高，数据可靠，可用于实际环境水样中加替沙星的分析检测。

表2水样加替沙星回收率

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。