一种新的高通量筛选溶酶体的方法与流程

本发明属于天然产物及医药技术领域，具体地涉及一种新的高通量筛选溶酶体的方法。

背景技术：

天然产物是最大最好的药物来源库并具有独特的生物活性机制，还有立体构型的优势。天然药物一直是人类防病治病的主要来源。近几十年我国研究的天然植物1000余种，鉴定已知化合物成分10000多种，提取分离出新化合物成分2000多种，主要针对癌症肿瘤、心脑血管、老年痴呆症（阿尔茨海默病）、免疫力低下等国内外尚无特效药的疾病，以及抗血小板活化因子、抗内毒素、抗乙型肝炎、抗真菌等有效成分研究。由于天然产物种类繁多，因此高通量筛选也逐渐深入。

高通量筛选(highthroughputscreening,hts)是20世纪80年代中期产生的为寻找先导物针对大量样品进行药理活性评价分析的一种技术手段，在创新药物的研究和开发中发挥了重要作用。目前，hts技术已经使对大量化合物样品进行筛选成为现实。基于细胞的高内涵筛选(highcontentscreening,hcs)技术实现了对化合物多靶点多参数的同时检测，使得人们从疾病相关基因调控通路和网络水平上研究药物的作用机制、代谢途径和潜在毒性等，也使在细胞水平全面评价活性化合物的成药性成为可能，在新药研发中发挥越来越重要的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的高通量筛选溶酶体的方法，该方法高通量初步筛选大量天然小分子化合物基于细胞水平对溶酶体的影响，与传统方法相比，极大的提高了效率。

本发明目的是通过下述方案得以实现：

一种新的高通量筛选溶酶体的方法，包括以下步骤：

1）细胞培养并加药处理：

首先，将化合物各取2mg用dmso配制成母液20mm/l，并各取20µm装入八连管中，母液及工作液都放入-20℃储存；选取hela细胞作为从细胞水平对化合物的抗肿瘤活性的一个初步筛选；培养细胞，待细胞生长至对数期，用胰酶消化细胞，并放于用含10％胎牛血清的培养液(dmem)配成细胞悬液，并充分摇匀，以每孔10000个细胞接种到96孔细胞培养板，在96孔细胞培养板中加入hela细胞悬液100µl，待细胞贴壁后，加药处理细胞4h后用用lysotrackerreddnd99在避光条件下染色30min；

2）高内涵药物筛选仪测细胞溶酶体的荧光强度：

将96孔细胞培养板放入筛选仪，进行荧光筛选模式的选择进入细胞扫描页面，选择485nm波长，单通道，板子类型及像素的选择；自动对焦，选择扫描所有细胞孔及孔里的8个视野；扫描完之后，对细胞稍微处理一下，把过大过小细胞删除，连在一起的细胞选择界限切开；细胞处理完之后，选择查看仪器记录的objectsizech1、objecttotalintench1、objectavglintench1这三个参数；根据每个孔的平均荧光强度与对照组比，判断化合物是使细胞溶酶体增多还是减少，即可以高通量初步筛选出对细胞溶酶体有影响的化合物；

3）激光共聚焦或正置荧光显微镜验证活性化合物：

将hela细胞悬液加入激光共聚焦小皿，每个小皿加2ml的细胞悬液，待细胞密度长致70%，加药处理3-4h后，用lysotrackerreddnd99在避光条件下染色30min；并在正置荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜下，以488nm为波长进行拍照，从而观察细胞形态及荧光强度。

上述的一种新的高通量筛选溶酶体的方法，其中：步骤2）将96孔细胞培养板放入筛选仪时注意避光。

上述的一种新的高通量筛选溶酶体的方法，其中：步骤2）一块板通过高内涵的扫描时间在18-22min，能提高筛选效率。

本发明的有益效果：

1、本发明利用高通量筛选技术，利用荧光强度，从大量化合物中初步筛选出对细胞溶酶体有影响的化合物。

2、本发明与原始的通过激光共聚焦拍照筛选相比极大的节省了时间，减少了荧光淬灭时间，处理结果更加的及时，提高效率。

3、将通过高内涵筛选仪初步筛选到的对细胞溶酶体有影响的化合物再次用正置荧光显微镜或激光共聚焦筛选溶酶体的方法进行验证高内涵筛选的结果是否可用，结果能抑制溶酶体的生成。

附图说明

图1是高内涵筛选40μm的化合物处理hela细胞lysotracker着色后的平均荧光强度。

图2是40μm的化合物j3、j4、j5处理hela细胞以lysotracker着色后的荧光图片。

具体实施方式

以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种新的高通量筛选溶酶体的方法具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。

一种新的高通量筛选溶酶体的方法，包括以下步骤：

1）细胞培养并加药处理：首先，将131-j5这40个化合物用dmso配制成母液20mm/l，并各取20µm装入八连管中，放入4℃待用。培养hela细胞，待细胞生长良好并至对数期，用胰酶消化细胞，并放于用含10％胎牛血清的培养液(dmem)配成细胞悬液，并充分摇匀，以每孔10000个细胞接种到96孔细胞培养板，在96孔细胞培养板中加入hela细胞悬液100µl，放入37℃细胞培养箱孵育过夜，第二天待细胞贴壁后，加入预先准备好的化合物处理hela细胞4h后，用lysotrackerreddnd99在避光条件下染色30min，注意避光。

2）高内涵药物筛选仪测细胞溶酶体的荧光强度：将处理好的96孔细胞培养板放入筛选仪，进行荧光筛选模式的选择进入细胞扫描页面，选择485nm波长，单通道，板子类型及像素的选择；自动对焦，选择扫描所有细胞孔及孔里的8个视野；扫描完之后，对细胞稍微处理一下，把过大过小细胞删除，连在一起的细胞选择界限切开；细胞处理完之后，选择查看仪器记录的objectsizech1、objecttotalintench1、objectavglintench1这三个参数；根据每个孔的平均荧光强度与对照组比，判断化合物是使细胞溶酶体增多还是减少，即可以高通量初步筛选出对细胞溶酶体有影响的化合物。

3）激光共聚焦或正置荧光显微镜验证活性化合物：将hela细胞悬液加入激光共聚焦小皿，每个小皿加2ml的细胞悬液，待细胞密度长致70%，加入初步筛选到的对溶酶体有影响的化合物j3、j4、j5处理细胞3-4h后，用lysotrackerreddnd99在避光条件下染色30min；并在正置荧光显微镜或激光共聚焦扫描显微镜下，以488nm为波长进行拍照，从而观察细胞形态及荧光强度。

本发明溶酶体筛选结果：

将hela细胞以40μm浓度的化合物131-j5这40个化合物处理4h后，用lysotrackerreddnd99染料染色半小时，并用高内涵药物筛选仪分析并计算出细胞密度以及荧光强度，各化合物的平均荧光强度如下图1。

数据分析原始数据使用graphpadprism5.0生成柱状图。采用spss17.0统计学软件，组间比较采用单因素方差分析及配对t检验，以p<0.05差异显著为*，p<0.01差异极显著为**。结果如表1，化合物j3、j5处理组与对照组相比差异显著（p<0.05）；阳性对照组、化合物j4处理组与对照组相比差异极显著（p<0.01），通过平均荧光强度的比较，初步判断，这三个化合物能抑制溶酶体的酸化，且化合物j4的抑制效果相对较明显。初步筛选完后，利用激光共聚焦扫描显微镜或正置置荧光显微镜具体观察，可发现，加药组的荧光强度相比对照组明显降低，如图2。由此可判断这类化合物能抑制溶酶体的生成。

天然小分子化合物促进肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤药物发展的前期基础研究，最新的研究也表明恶性肿瘤的发生、发展以及稳态调控与细胞自噬及溶酶体的调控和功能密切相关，这也是未来研究肿瘤治疗的热点和新方向。溶酶体是细胞内负责降解底物的细胞器，也是信号传导的重要枢纽。本实验通过高内涵对40个化合物进行初步筛选lysotrackerreddnd99荧光探针染色后化合物处理细胞的平均荧光强度，高速率的得到了有作用的3个化合物，并将这三个化合物分别处理的肿瘤细胞利用lysotrackerreddnd99荧光探针染色，荧光显微镜下观察拍照，从图片看出荧光强度显著降低，说明这3个化合物具有抑制溶酶体生成的作用。得以验证可以用高内涵筛选的方法来筛选对溶酶体有作用的化合物，并且此方法具有高速率的优势。

综上，本发明具有以下特点：

1、本发明利用高通量筛选技术，利用荧光强度，从大量化合物中初步筛选出对细胞溶酶体有影响的化合物。结果如图1。阳性药物对照组与对照组相比，平均荧光强度显著降低，则说明阳性药物抑制细胞溶酶体生成。通过对比其他化合物处理组与对照组，利用平均荧光强度与对照组的差异比较；如果平均荧光强度比对照组显著升高，则说明化合物促进细胞内溶酶体生成；若平均荧光强度显著降低，则说明化合物抑制细胞内溶酶体生成。并通过此方法初步筛选到对溶酶体有影响的化合物，如图1中平均荧光强度柱状图可以看出131、j3、j4、j5与对照组相比平均荧光强度降低，由此初步筛选到这几个化合物可能对细胞溶酶体有影响。

2、本发明与原始的通过激光共聚焦拍照筛选相比极大的节省了时间，减少了荧光淬灭时间，处理结果更加的及时，提高效率。

3、将步骤2）中通过高内涵筛选仪初步筛选到的对细胞溶酶体有影响的化合物j3、j4、j5再次用正置荧光显微镜或激光共聚焦筛选溶酶体的方法进行验证高内涵筛选的结果是否可用。首先将hela细胞以40μm浓度的化合物j3、j4、j5处理4h后，用lysotrackerreddnd99染料染色半小时，并用高内涵药物筛选仪选取红色荧光拍摄，并计算出细胞密度以及荧光强度，通过平均荧光强度的比较，初步判断，这三个化合物能抑制溶酶体的酸化，且化合物j4的抑制效果相对较明显。初步筛选完后，利用激光共聚焦显微镜和正置荧光显微镜具体观察，可发现，加药组的荧光强度相对对照组明显降低。结果如图2，由此可判断这3个化合物能抑制溶酶体的生成。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。