一种检测脂肪酶活性的方法、试剂盒及速测卡与流程

本发明涉及脂肪酶活性检测领域，特别涉及一种检测脂肪酶活性的方法、试剂盒及速测卡。
背景技术：
：脂肪酶是一种脂肪水解酶类，其水解底物一般是天然油脂，其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键。不同于其它水解酶，脂肪酶催化作用系统是一种非均相体系。水溶性的酶催化作用发生在水不溶性底物和水的界面上，这种界面上的催化作用机制仍不甚清楚。有人提出了脂肪酶在油-水界向上定位的假设，提出了“超底物”的模型，该模型能解释脂肪酶的一些行为，但还需要进一步的实验证明和修正。此外，脂肪酶兼具有逆向催化甘油和游离脂肪酸合成甘油脂活性。目前脂肪酶主要由动物组织提取和基因工程菌发酵生产来获取。脂肪酶在精细化工、食品加工、油脂工业等领域有广泛应用。脂肪酶作为一种生物源性食品添加剂应用于烘焙面制品中取代其他化学添加剂，改善产品的质量；在洗涤领域可促进脂肪类污渍的快速分解，提高洗涤剂的洗涤能力。脂肪酶活性是脂肪酶的一个重要指标。测定脂肪酶活性的方法可分三类：(1)通过测定底物的减少业度量酶活的大小；(2)测定产物增加判断酶活的大小；(3)其他方法(参见郑毅,叶海梅,周虓,etal.脂肪酶活力测定研究进展[j].工业微生物,2005,35(4):36-40.)。现有脂肪酶活性检测方法主要有碱滴定法、对硝基苯酚法、荧光法、胶体金法等，普遍存在操作繁琐复杂、需要多种化学试剂和昂贵仪器设备等缺陷，特别是无法实现脂肪酶活性的快速半定量检测。开发出一种操作简便，对设备及仪器要求低的脂肪酶活性检测方法、试剂盒及速测卡具有非常实际的意义。酯酶和脂肪酶能够用在立体专一的水解、酯基转移、酯合成和其他有机生物合成反应中。酯酶催化酯键的形成和断裂。脂肪酶能够通过界面活化这一现象与酯酶区分出来。因为界面活化只在脂肪酶中观察到。脂肪酶倾向于更多不溶于水的底物，典型的包括由长的脂肪酸链组成的甘油三酯。酯酶则更倾向于水解简单的酯类，通常只能够水解脂肪酸少于6个的甘油三酯。2,6-二氯靛酚乙酯是一种显色指示剂，结构式为显红色，其可在酯酶的作用下水解为蓝色的利用这一显色原理，2,6-二氯靛酚乙酯可以作为底物检测农药残留，未见报导使用2,6-二氯靛酚乙酯来检测脂肪酶活性。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种操作简便、对仪器要求低的脂肪酶活性检测方法、试剂盒及速测卡。发明人将尝试将2,6-二氯靛酚乙酯作为底物，期望利用其显色反应来检测脂肪酶活性，发现2,6-二氯靛酚乙酯受到显色底物与酶接触速度、脂肪酶单位活力、显色底物稳定性等多方面限制。单纯显色底物在纸基介质上不稳定情况被放大，更易降解，显色时间明显延长且显色过程由红色向紫色变化，颜色变化不明显且难于辨认，无法直接用于脂肪酶活性的检测。本发明所采取的技术方案是：一种检测脂肪酶活性的方法，包括如下步骤：1)将2,6-二氯靛酚乙酯、显色促进剂混合均匀，得到检测液；2)在检测液中加入待测脂肪酶液，反应显色，根据反应前后的颜色变化，确定脂肪酶的酶活。作为上述方法的进一步改进，检测液还添加有稳定剂、乳化剂中的至少一种。作为上述方法的进一步改进，显色促进剂为氯化钙和氯化钴中的至少一种；优选的，显色促进剂在检测液中的终浓度为5～100mmol/l。作为上述方法的进一步改进，稳定剂为葡聚糖；优选的，葡聚糖在检测液中的质量百分含量为0.01％～5％。作为上述方法的进一步改进，乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮；优选的，聚乙烯吡咯烷酮在检测液中的质量百分含量为0.01％～5％。一种检测脂肪酶活性的试剂盒，包括2,6-二氯靛酚乙酯、显色促进剂，显色促进剂为氯化钙和氯化钴中的至少一种；优选的，还包括稳定剂、乳化剂中的至少一种。作为上述试剂盒的进一步改进，稳定剂为葡聚糖；乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮。一种检测脂肪酶活性的速测卡，包括底板、显色底物片和上盖膜，显色底物片固定有2,6-二氯靛酚乙酯、显色促进剂，显色促进剂为氯化钙和氯化钴中的至少一种。作为上述速测卡的进一步改进，显色底物片还固定有稳定剂、乳化剂中的至少一种。作为上述速测卡的进一步改进，稳定剂为葡聚糖；乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮。本发明的有益效果是：本发明的技术，通过使用显色促进剂，使得2,6-二氯靛酚乙酯可以应用于低酶活脂肪酶活性的检测，并可根据反应后的显色情况半定量地确定脂肪酶的酶活，使得制备脂肪酶活性速测卡成为可能。通过进一步使用稳定剂，可以提高产品的保存稳定性，方便制成速测卡。当2,6-二氯靛酚乙酯使用其他方法可以稳定保存且临用时配制检测液时，可以省略使用稳定剂。通过进一步使用乳化剂，可以进一步提高显色剂2,6-二氯靛酚乙酯的分散情况，分散更为均匀，同时可以更好地脂肪酶接解反应，有利于更快、更好地获得检测结果。附图说明图1是实施例1速测卡的显色实验结果；图2是市售农药残留速测卡的显色实验结果；图3是脂肪酶抑制测试的实验结果。具体实施方式一种检测脂肪酶活性的方法，包括如下步骤：1)将2,6-二氯靛酚乙酯、显色促进剂混合均匀，得到检测液；2)在检测液中加入待测脂肪酶液，反应显色，根据反应前后的颜色变化，确定脂肪酶的酶活。作为上述方法的进一步改进，检测液还添加有稳定剂、乳化剂中的至少一种。稳定剂的作用在于使显色剂2,6-二氯靛酚乙酯更为稳定的存在。一般而言，可以使用不影响反应及观察的高分子作为稳定剂，分子量高的一般具有更好地稳定效果，可以延长检测卡的保质期。由于酶液的反应体系一般为水性液体，为保证反应的均匀性，稳定剂一般具有较好的水分散性。稳定剂的用量可以根据具体的反应情况进行相应的调整，或通过梯度实验确定最佳的用量。2,6-二氯靛酚乙酯为疏水性物质，水溶性较差，为提高其溶解度或分散性，可进一步添加乳化剂。乳化剂的用量可以根据具体的反应情况进行相应的调整，或通过梯度实验确定最佳的用量，以使2,6-二氯靛酚乙酯有效分散。作为上述方法的进一步改进，显色促进剂为氯化钙和氯化钴中的至少一种；优选的，显色促进剂在检测液中的终浓度为5～100mmol/l。作为上述方法的进一步改进，稳定剂为葡聚糖；优选的，葡聚糖在检测液中的质量百分含量为0.01％～5％。作为上述方法的进一步改进，乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮；优选的，聚乙烯吡咯烷酮在检测液中的质量百分含量为0.01％～5％。一种检测脂肪酶活性的试剂盒，包括2,6-二氯靛酚乙酯、显色促进剂，显色促进剂为氯化钙和氯化钴中的至少一种；优选的，还包括稳定剂、乳化剂中的至少一种。作为上述试剂盒的进一步改进，稳定剂为葡聚糖；乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮。一种检测脂肪酶活性的速测卡，包括底板、显色底物片和上盖膜，显色底物片固定有2,6-二氯靛酚乙酯、显色促进剂，显色促进剂为氯化钙和氯化钴中的至少一种。作为上述速测卡的进一步改进，显色底物片还固定有稳定剂、乳化剂中的至少一种。作为上述速测卡的进一步改进，稳定剂为葡聚糖；乳化剂为聚乙烯吡咯烷酮。一种脂肪酶半定量速测卡，其结构主要由底板、显色底物片、盖膜组成，底板固定有显色底物片，并被上盖膜覆盖。优选的，所述底板由可以降解的合成纸材料制成，上盖膜由覆有热敏胶的opp膜制成。当然，也可以使用其他材料制备得到。下面结合实施例，进一步说明本发明的技术。以下实施例中，如未特别说明，百分含量指质量百分含量。实施例1在直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附15mg2,6-二氯靛酚乙酯、以及0.1％葡聚糖、0.05％聚乙烯吡咯烷酮和25mmol/l氯化钙的混合液，烘干，制成显色底物片，装配成为脂肪酶半定量速测卡。实施例2在直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附10mg2,6-二氯靛酚乙酯、以及0.05％聚乙烯吡咯烷酮和15mmol/l氯化钙的混合液，烘干，制成显色底物片，装配成为脂肪酶半定量速测卡。实施例3在直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附0.2mg2,6-二氯靛酚乙酯、以及0.01％葡聚糖、0.01％聚乙烯吡咯烷酮和5mmol/l氯化钙的混合液，烘干，制成显色底物片，装配成为脂肪酶半定量速测卡。实施例4在直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附0.2mg2,6-二氯靛酚乙酯、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和95mmol/l氯化钙的混合液，烘干，制成显色底物片，装配成为脂肪酶半定量速测卡。实施例5同实施例1，不同之处在于25mmol/l氯化钙替换为15mmol/l氯化钙和10mmol/l氯化钴。对比例1在直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附15mg2,6-二氯靛酚乙酯、以及15mmol/l氯化钙的混合液，烘干，制成显色底物片，装配成为脂肪酶半定量速测卡。对比例2在直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附15mg2,6-二氯靛酚乙酯、以及0.05％聚乙烯吡咯烷酮的混合液，烘干，制成显色底物片，装配成为脂肪酶半定量速测卡。对比例3在直径为12mm的圆形吸水滤纸，均匀吸附15mg2,6-二氯靛酚乙酯，制成显色底物片，装配成为脂肪酶半定量速测卡。使用脂肪酶活性半定量速测卡的过程如下：1、标准曲线及色卡建立根据购进脂肪酶产品标注的酶活单位将脂肪酶用纯净水配成每毫升200单位的酶溶液，并进行十倍稀释，取制备的速测卡分别滴加各酶梯度稀释液50微升，同时滴加蒸馏水为空白对照。反应3min后即可获得酶活色卡；或者滴加酶抑制剂抑制酶活性，固定显色程度后，可配合光线仪器进行吸光值测定，绘制标准曲线，建立酶活测定标准。检测结果：取实施例1、对比例1～3制备的速测卡分别滴加各酶梯度稀释液50微升，同时滴加蒸馏水为空白对照。反应3min后记录显色情况，其结果如图1和下表所示：空白对照200u/ml20u/ml实施例1橙黄色深蓝色天蓝色实施例3橙黄色深蓝色天蓝色实施例4橙黄色深蓝色蓝色实施例5橙黄色深蓝色蓝色对比例1橙黄色浅蓝色橙黄色对比例2橙黄色浅蓝色橙黄色对比例3橙黄色淡紫色淡黄色反应延长至10min后，三组实施例的速测卡都为深蓝色，而对比例1、2仍维持浅蓝色至淡黄色之间，说明缺乏乳化剂或显色促进剂时反应速率大幅下降，明显延长显色时间，降低产品使用体验和便利程度。对比例3的速测卡反应至10min后呈淡紫色至紫色之间，单纯用2,6-二氯靛酚乙酯制作的速测卡反应后颜色变化不符合本发明设计颜色变化。分别使用市购的3种以2,6-二氯靛酚乙酯为底物的农药残留速测卡，参照上述方法对200u/ml的脂肪酶活性进行检测。检测结果如图2所示，表明现有以2,6-二氯靛酚乙酯为底物的农药残留速测卡无法用于脂肪酶活性的检测。2、脂肪酶活性测试：根据购进脂肪酶产品标注的酶活单位将脂肪酶用纯净水配成每毫升200单位的酶溶液，并进行十倍稀释，取制备的速测卡分别滴加各酶梯度稀释液50微升，同时滴加蒸馏水为空白对照。反应3min后根据速测卡显色情况进行酶活判定。也可根据事先建立的色卡或标准曲线进行脂肪酶活性分级。3、脂肪酶抑制测试准确称取脂肪酶抑制剂奥利司他0.1g溶于100ml乙醇中，并稀释成500ppm、50ppm、5ppm三个梯度浓度，先滴加各稀释度奥利司他20微升到本速测卡上，再滴加50微升200u/ml脂肪酶溶液到实施例1制备的速测卡上，反应3min后判定。其结果如下表和图3所示：4、速测卡稳定性试验将实施例1、2、4所制备的速测卡放置在30℃恒温环境下进行产品储存期加速试验；并于第1、7、15天取卡片接千分之一酶液，记录显色结果。从加速试验结果可知，为加稳定剂的速测卡在室温放置短时间内即由于显色剂被破坏而失去作用，而加有稳定剂的速测卡保持稳定。当前第1页12