参类药材中抗凝药效成分的确定方法与流程

本发明涉及中药
技术领域：
，特别涉及一种参类药材中抗凝药效成分的确定方法。
背景技术：
：中药药效物质辨识一直是中药研究的热点和难点，特别是中药普遍具有多成分、多靶点、多途径的作用的特点，在传统应用中也具有多规格等级、多功效取向的特点，这更增加了中药临床应用的复杂性和物质基础研究的难度。在中药临床应用中，常具有多种不同功效，这些功效可能截然相反或者是“双向调节”，这种现象，或出现在不同的规格等级下，或者表现在不同的用药剂量下，或者表现在不同的机体病症状态下；这就需要进一步深入研究中药的药效物质基础，特别是针对具体病症、具体用药环境下参加药效表达的具体物质，以期为更准确了解中药功效发挥的物质-机制提供科学依据。同科同属具有密切亲缘关系的植物均做药用，是中药一种特殊和高效的药物发现形式，在传统用药经验积累的基础上总结得到的同科属植物药效的共同点与不同点，为中药临床用药比较辨识提高提供了丰富的临床依据。现代研究表明，同科属植物化学本底基本一致，功能主治近似，但各有差异。对每一个不同的药材，其功效具有相对的取向性的不同，这为基于信息差异的药效成分发现与辨识提供了一条不可多得的有效途径。譬如对于活性成分为近似相同的一类人参皂苷类成分的同科同属植物，为了准确发现某一具体的化学成分在药效作用中的贡献与地位，急需一种高效的研究方法，以从极其繁杂的化学成分中寻找高效、特异、具有导向性的化学物质。从传统功效上来看，五加科人参属药材基本上都具有“补”与“活”两种性质的功效，只是对于不同药物其侧重点不同，如人参与红参大补元气，三七散瘀止血，竹节参补虚强壮，珠子参为竹节参的近亲变种，二者功效近似。另外，在临床使用时，不同的剂量下各药物体现出来的活性各有差异，比如，人参低剂量体现出一定的活血作用，高剂量活性功能基本消失；三七低剂量止血作用更强，中、高剂量活血作用更显著。此外，在使用方法上，也可能导致功效发挥的差异，比如超声波法比传统水煎法、醇提法、微波提取法效果更好，醇提取比水提效果更好。这些临床功效表现的差异，归根结底还可能主要来源于药效成分组组成差异和含量差异，对于化学本底基本一致的同科同属植物，在化学成分基本相似的基础上，通过对化学成分差异的比较研究，找寻各药物对应功效侧重的特异性药效物质或者引导性物质，准确辨识这些成分，对于进一步明确针对不同功效目的下的主要药效物质组成，对临床准确选药、合理用药、精准分析控制都有重要意义。技术实现要素：本发明的主要目的是提出一种参类药材中抗凝药效成分的确定方法，旨在解决中药成分复杂，难以确定具有药效的具体成分的问题。为实现上述目的，本发明提出一种参类药材中抗凝药效成分的确定方法，包括以下步骤：分别对多个参类药材样品进行皂苷成分提取，得到与各参类药材样品对应的第一提取物，其中所述参类药材样品属于不同品种；通过液相色谱-质谱联用仪分别对各第一提取物进行分析，得到与各第一提取物分别对应的色谱图；从所述色谱图中选取若干备选峰；从所述第一提取物中选取待处理提取物，配置所述待处理提取物的水溶液；对所述待处理提取物的水溶液进行凝血活性测试，获得凝血活性测试结果，对所述待处理提取物的水溶液中与各备选峰对应成分的含量及所述凝血活性测试结果进行灰色关联分析，以确定所述备选峰中具有药效的目标成分对应的目标峰；根据各目标峰对应的质谱图，确定各目标峰对应的目标成分。优选地，所述从所述色谱图中选取若干备选峰，具体包括：对各第一提取物对应的色谱图中的色谱峰进行匹配；将匹配成功的色谱峰作为所述备选峰。优选地，所述从所述提取物中选取待处理提取物，配置所述待处理提取物的水溶液之后，所述方法还包括：基于所述备选峰在所述待处理提取物的色谱图中的峰面积，确定待处理提取物的水溶液中与各目标峰对应的各成分的含量。优选地，所述分别对多个参类药材样品进行皂苷成分提取，得到与各参类药材样品对应的第一提取物，具体包括：分别对多个参类药材样品进行乙醇提取、浓缩、洗涤及萃取操作，得到与各参类药材样品对应的第一提取物。优选地，所述分别对多个参类药材样品进行乙醇提取、浓缩、洗涤及萃取操作，得到与各参类药材样品对应的第一提取物，具体包括：分别对多个参类药材样品进行多次乙醇回流提取，收集提取液；对所述提取液进行离心后，减压浓缩至干，再用水溶解，得水溶液；通过石油醚对所述水溶液进行洗涤，保留水层溶液；通过醇类萃取剂对所述水层溶液进行多次，合并萃取液；对所述萃取液进行纯水洗涤，合并洗涤液，减压浓缩至干，得到与各参类药材样品对应的第一提取物。优选地，所述分别对多个参类样品进行乙醇提取、浓缩、洗涤及萃取操作，得到与各参类药材样品对应的第一提取物之后，所述方法还包括：从所述参数类样品中选取目标参类药材样品，并通过不同浓度的乙醇溶液对所述目标参类药材样品进行提取、浓缩、洗涤及萃取操作，得到与所述目标参类药材样品对应的第二提取物；通过液相色谱-质谱联用仪分别对所述第二提取物进行分析，得到与所述第二提取物对应的色谱图；通过第一提取物和第二提取物的色谱图对所述第一提取物和第二提取物进行主成分分析，确定制备方式对参类药材中药性成分含量的影响。优选地，所述分别对多个参类药材样品进行多次乙醇回流提取，收集提取液，具体包括：通过8倍量的75％乙醇溶液分别对多个参类药材样品进行2次回流，回流时间为2～3.5h，收集提取液。优选地，所述根据各目标峰对应的质谱图，确定各目标峰对应的目标成分之后，所述方法还包括：通过所述目标成分与凝血酶的分子对接效果，对所述目标成分的药效进行验证。优选地，所述通过所述目标成分与凝血酶的分子对接效果，对所述目标成分的药效进行验证，具体包括：获取凝血酶和各目标成分的分子模型；从所述凝血酶的分子模型中选取活性位点；基于各目标成分的分子模型与活性位点的结合情况，确定各目标成分的药效。优选地，所述从所述提取物中选取待处理提取物，配置所述待处理提取物的水溶液，具体包括：从所述提取物中选取待处理提取物，配置不同浓度的所述待处理提取物的水溶液；相应地，所述对所述提取物的水溶液进行凝血活性测试，获得凝血活性测试结果，对所述待处理提取物的水溶液中与各备选峰对应的各成分的含量及凝血活性测试结果进行灰色关联分析，从所述备选峰中确定参类药材中具有药效的目标成分对应的目标峰，具体包括：分别对各种浓度的所述待处理提取物的水溶液进行凝血活性测试，获得与各水溶液对应的凝血活性测试结果，对各水溶液中与各备选峰对应的各成分的含量值及凝血活性测试结果进行灰色关联分析，确定参类药材中具有药效的目标成分对应的目标峰，及各目标成分的药效与浓度的对应关系。本发明提供的技术方案中，对多个参类药材样品进行皂苷成分提取，得到与各参类药材样品对应的第一提取物，通过液-质联用仪分别对各第一提取物进行分析，得到与各第一提取物分别对应的色谱图，从所述色谱图中选取若干备选峰，从第一提取物中选取待处理提取物，配置待处理提取物的水溶液，对待处理提取物的水溶液进行凝血活性测试，获得凝血活性测试结果，对待处理提取物的水溶液中与各备选峰对应成分的含量及所述凝血活性测试结果进行灰色关联分析，以确定所述备选峰中具有药效的目标成分对应的目标峰，根据各目标峰对应的质谱图，确定各目标峰对应的目标成分。本发明方法可以高效、准确地确定参类药材中具有药效的成分。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明提供的参类药材中抗凝药效成分的确定方法的一实施例的流程示意图；图2为本发明中各第一提取物的色谱图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明提出一种参类药材中抗凝药效成分的确定方法，图1为本发明提供的所述参类药材中抗凝药效成分的确定方法方法的一实施例。请参阅图1，所述参类药材中抗凝药效成分的确定方法方法包括以下步骤：步骤s10：分别对多个参类药材样品进行皂苷成分提取，得到与各参类药材样品对应的第一提取物，其中所述参类药材样品属于不同品种。需要说明的是，本方案中的“第一提取物”的“第一”并不构成对所述提取物的限定，只是用于对本方案中的其它类型的提取物进行区分，所述“第一提取物”并不代表一个提取物，而是代表一类提取物，即对参类药材样品进行皂苷成分提取，得到的提取物统称为“第一提取物”。具体提取时，可以分别对多个参类药材样品进行乙醇提取、浓缩、洗涤及萃取操作，得到与各参类药材样品对应的第一提取物。进一步地，可以通过以下方式实现：分别对多个参类药材样品进行多次乙醇回流提取，收集提取液；对所述提取液进行离心后，减压浓缩至干，再用水溶解，得水溶液；通过石油醚对所述水溶液进行洗涤，保留水层溶液；通过醇类萃取剂对所述水层溶液进行多次，合并萃取液；对所述萃取液进行纯水洗涤，合并洗涤液，减压浓缩至干，得到与各参类药材样品对应的第一提取物。本实施例中，所述乙醇提取的反应条件为：通过8倍量的75％乙醇溶液分别对多个参类药材样品进行2次回流，回流时间为2～3.5h，合并提取液。步骤s20：通过液相色谱-质谱联用仪分别对各第一提取物进行分析，得到与各第一提取物分别对应的色谱图。步骤s30：从所述色谱图中选取若干备选峰。具体地，可以对各第一提取物对应的色谱图中的色谱峰进行匹配，将匹配成功的色谱峰作为所述备选峰。具体实现时，在对各第一提取物对应的色谱图中的色谱峰进行匹配时，可以将所有图谱中都出现的峰作为所述备选峰；也可以设定一定的次数要求，将满足预设的次数要求的峰作为所述备选峰。比如，在所述第一提取物为5个时，可以将出现5次的峰作为备选峰，也可以将出现4次以上的峰作为备选峰，本实施例对此不加以限制。步骤s40：从所述第一提取物中选取待处理提取物，配置所述待处理提取物的水溶液。步骤s50：对所述待处理提取物的水溶液进行凝血活性测试，获得凝血活性测试结果，对所述待处理提取物的水溶液中与各备选峰对应成分的含量及所述凝血活性测试结果进行灰色关联分析，以确定所述备选峰中具有药效的目标成分对应的目标峰。在配置了所述待处理提取物的水溶液之后，可以基于所述备选峰在所述待处理提取物的色谱图中的峰面积，确定待处理提取物的水溶液中与各目标峰对应的各成分的含量。可以理解的是，对一种浓度的待处理提取物的水溶液进行凝血活性测试，对待处理提取物一种浓度的水溶液中与各备选峰对应成分的含量及所述凝血活性测试结果进行灰色关联分析时，可以确定所述备选峰中具有药效的目标成分对应的目标峰，但是，在通过在对待处理提取物不同浓度的水溶液进行灰色关联分析时，则可以确定各目标成分的药效与浓度的对应关系。具体地，可以从所述提取物中选取待处理提取物，配置不同浓度的所述待处理提取物的水溶液；分别对各种浓度的所述待处理提取物的水溶液进行凝血活性测试，获得与各水溶液对应的凝血活性测试结果，对各水溶液中与各备选峰对应的各成分的含量值及凝血活性测试结果进行灰色关联分析，确定参类药材中具有药效的目标成分对应的目标峰，及各目标成分的药效与浓度的对应关系。步骤s60：根据各目标峰对应的质谱图，确定各目标峰对应的目标成分。本实施例中，在确定各目标峰对应的目标成分之后，可以通过所述目标成分与凝血酶的分子对接效果，对所述目标分子的药效进行验证。具体地，可以通过以下方式实现：获取凝血酶和各目标成分的分子模型；从所述凝血酶的分子模型中选取活性位点；基于各目标成分的分子模型与活性位点的结合情况，确定各目标成分的药效。为了进一步考察参类药材中，提取条件对提取物的影响，可以从所述参数类样品中选取目标参类药材样品，并通过不同浓度的乙醇溶液对所述目标参类药材样品进行提取、浓缩、洗涤及萃取操作，得到与所述目标参类药材样品对应的第二提取物；通过液相色谱-质谱联用仪分别对所述第二提取物进行分析，得到与所述第二提取物对应的色谱图；通过第二提取物的色谱图对所述第二提取物进行主成分分析，确定制备方式对参类药材中药性成分含量的影响。本发明提供的技术方案中，对多个参类药材样品进行皂苷成分提取，得到与各参类药材样品对应的第一提取物，通过液-质联用仪分别对各第一提取物进行分析，得到与各第一提取物分别对应的色谱图，从所述色谱图中选取若干备选峰，从第一提取物中选取待处理提取物，配置待处理提取物的水溶液，对待处理提取物的水溶液进行凝血活性测试，获得凝血活性测试结果，对待处理提取物的水溶液中与各备选峰对应成分的含量及所述凝血活性测试结果进行灰色关联分析，以确定所述备选峰中具有药效的目标成分对应的目标峰，根据各目标峰对应的质谱图，确定各目标峰对应的目标成分。本发明方法可以高效、准确地确定参类药材中具有药效的成分。以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中涉及的材料：仪器：高效液相色谱仪(agilent1200hplc)，色谱柱为welchxtimateuplcc18色谱柱(100mm×2.1mm，1.8μm)；质谱仪(agilent6420triplequadlc/ms)；cp214型电子分析天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；tgl16a型离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)；xn06-ii型半自动凝血分析仪(武汉景川诊断技术股份有限公司)；移液器(规格：20μl、50μl、100μl，普兰德(上海)有限公司)药材：人参(吉林抚松，人参属植物人参panaxginsengc.a.mey的干燥根和根茎)、红参为前述人参经蒸制干燥后的炮制品、三七(云南文山，人参属植物三七panaxnotoginseng(burk.)f.h.chen的干燥根和根茎)、竹节参(湖北恩施，人参属植物竹节参panaxjaponicusc.a.mey.干燥根和根茎)、珠子参(云南大理，人参属植物珠子参panaxpseudoginsengwall.var.major(burkill)h.l.li的干燥根和根茎)，上述样品经过中南民族大学任永申博士鉴定为正品。试剂：tt试剂盒(10×2ml)；aptt试剂盒(5×2ml)；pt试剂盒(10×2ml)；fib试剂盒(10×2ml)；血浆。涉及的凝血活性测试方法：凝血酶原时间(pt)测定：测试杯中加入血浆和实验组溶液(空白组加生理盐水)各50μl，随即放入37℃恒温槽温育3min，预热完毕后将测试杯放入测试孔中，加100μlpt试剂，记录血液凝固时间。凝血酶时间(tt)测定：测试杯中加入血浆和实验组溶液各50μl，随即放入37℃恒温槽温育3min，预热完毕后将测试杯放入测试孔中，加100μltt试剂，记录血液凝固时间。活化部分凝血活酶时间(aptt)测定：测试杯中加入血浆和实验组溶液各25μl，再加50μlaptt试剂，混匀，随即放入37℃恒温槽温育3min，预热完毕后将测试杯放入测试孔中，加入50μlcacl2(浓度为0.025mol/l)，记录血液凝固时间。纤维蛋白原含量(fib)测定：测试杯中加入血浆5μl和咪唑缓冲溶液45μl，再加入实验组溶液50μl，混匀，随即放入37℃恒温槽温育3min，预热完毕后将测试杯放入测试孔中，加入50μlfib试剂，记录数据。绘制时间-含量双对数曲线，得fib值。校准程序：将标准血浆用咪唑缓冲液稀释，分别进行5倍、10倍、20倍、30倍稀释，采用2.2.3中的fib测定步骤，测得凝血时间，以用双对数坐标图绘制标准曲线，以血浆含量的对数为y轴，凝固时间的对数为x轴，得标准曲线为：y＝1.0905x+0.1678，r2＝0.9992，呈良好的线性关系。实施例1(1)分别取三七干燥根茎、人参干燥根茎、红参干燥根茎、竹节参干燥根茎及珠子参干燥根茎，粉碎，过筛(65目)，每份称取粉末10.0g，分别加入80ml75％乙醇，加热至微沸后，回流提取2次，每次3h，合并提取液，离心(8000r/min，10min，20℃)后减压浓缩(60℃)至干，再用10ml水溶解，石油醚洗涤三次后弃去上层液，水层用正丁醇萃取三次，合并正丁醇液，再用纯化水洗涤三次后浓缩至干，分别得第一提取物s1、s2、s3、s4及s5，其中s1为三七干燥根茎的第一提取物，s2为人参干燥根茎的第一提取物，s3为红参干燥根茎的第一提取物，s4为竹节参干燥根茎的第一提取物，s5为珠子参干燥根茎的第一提取物。(2)通过液相色谱-质谱联用仪分别对s1、s2、s3、s4及s5进行分析，得到与s1、s2、s3、s4及s5分别对应的色谱图；(3)从所述色谱图中选取若干备选峰；(3)将三七干燥根茎的第一提取物s1中选为待处理提取物，配置所述待处理提取物的水溶液，配置的水溶液的浓度为50mg/ml；(4)对所述待处理提取物的水溶液进行凝血活性测试，获得凝血活性测试结果，对所述待处理提取物的水溶液中与各备选峰对应成分的含量及所述凝血活性测试结果进行灰色关联分析，以确定所述备选峰中具有药效的目标成分对应的目标峰；(5)获取各目标峰的质谱图，经过质谱图分析、标准品对照，确定各目标峰对应的目标成分。实施例2(1)取三七干燥根茎，粉碎，过筛(65目)，每份称取粉末10.0g，分别加入80ml纯水、35％乙醇及95％乙醇，加热至微沸后，回流提取2次，每次3h，合并提取液，离心(8000r/min，10min，20℃)后减压浓缩(60℃)至干，再用10ml水溶解，石油醚洗涤三次后弃去上层液，水层用正丁醇萃取三次，合并正丁醇液，再用纯化水洗涤三次后浓缩至干，分别得第二提取物s6、s7及s8，其中，s6为三七干燥根茎在纯水条件下提取的第二提取物，s7为三七干燥根茎在35％乙醇条件下提取的第二提取物，s6为三七干燥根茎在95％乙醇条件下提取的第二提取物；(2)通过液相色谱-质谱联用仪分别对所述第二提取物s6、s7及s8进行分析，得到与所述第二提取物s6、s7及s8对应的色谱图；(3)通过s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7及s8色谱图对所述s1、s2、s3、s4、s5、s6、s7及s8进行主成分分析，确定制备方式对参类药材中药性成分含量的影响。实施例3(1)将三七干燥根茎的第一提取物s1中选为待处理提取物，配置所述待处理提取物的水溶液，配置的水溶液的浓度为50mg/ml、100mg/ml和300mg/ml；(4)分别对所述待处理提取物的水溶液进行凝血活性测试，获得凝血活性测试结果，对所述待处理提取物的水溶液中与各备选峰对应成分的含量及所述凝血活性测试结果进行灰色关联分析，确定各目标成分的药效与浓度的对应关系；实施例4(1)获取凝血酶和各目标成分的分子模型；(2)对凝血酶分子模型的结构进行优化，从所述凝血酶的分子模型中选取活性位点；(3)以阿司匹林作为参照物，基于各目标成分的分子模型与活性位点的结合情况，对所述目标成分进行打分，确定各目标成分的药效。实验1至实验4的结果如下：实验1：第一提取物s1-s5的色谱图如图2所示，通过对图谱中的峰进行匹配，确定了37个备选峰，37个备选峰已在图中标出，各第一提取物中，37个备选峰的峰面积如表1所示，通过灰色关联分析，确定峰10、26、31及36号对应的化学成分对整个抗凝过程均有影响，将峰10、26、31及36号确定为目标峰，将四个目标峰的质谱图与标准图谱比较，确定具有药效的目标成分。实际上，本方案中，通过与标准图谱对比，可以确定其中26个峰对应的成分，具体，可见表2。表1第一提取物色谱图峰面积表2三七提取物色谱图中的谱峰指认实验2：主成分分析结果：将s1-s8分为了四组，第一组：s1与s8，第二组：s6与s7，第三组：s2与s3，第四组：s5与s6，其中，第一组为三七高浓度乙醇提取组，第一、三组的总皂苷含量均显著高于其他组，不同样品在同样的中药提取工艺中获得的总皂苷含量不同；s2和s3相似度很高，可见炮制后的中药活性成分会发生较小的改变；第一组和第二组明显分离，同品种不同提取方法对样品中的化学成分影响非常大。实验3：10、15、20、26、33、34、36、31、27和37个峰对rtt值的贡献最大，33峰对rtt值受浓度影响，而且随着浓度的增加，贡献也会增加，另外，6、27、28、31、32、36、22、10、9、37对rpt值贡献最大，各化学成分对rpt的贡献几乎不受浓度影响。10、14、22、26、27、28、31、34、36、37的峰对raptt值影响最大，浓度对分析结果有一定影响，一些化学成分的贡献随浓度的增加而增加。随着浓度的增加，p7、14、20、31、26、36、15、22、8、33峰对纤维蛋白的贡献最大，7、8、20、22、26、33峰对纤维蛋白的贡献最大。实验4：打分结果，如表3所示，可见，目标峰10、26、31及36对应的目标成分的分数均高于阿司匹林，即验证了目标成分抗凝效果比较好。表3打分结果no.药物分子与凝血酶药理作用对接打分1阿司匹林抑制剂4.28522g-rg3药效成分8.99113g-ck药效成分8.32894g-f2药效成分8.0435ng-fe药效成分7.71576ng-fc药效成分7.40167g-rc药效成分6.78058g-rd药效成分6.7739g-rg2药效成分6.658110ng-t5药效成分5.526911ng-ft1药效成分5.484512g-rg1药效成分5.250513ng-r2药效成分5.125314g-f4药效成分4.860915g-rh2药效成分4.838316ng-r1药效成分4.797217cs-iva药效成分4.774518g-rb3药效成分4.111619g-ro药效成分3.731220g-re药效成分3.32621g-rf药效成分2.873822g-rb1药效成分1.2098综上所述，本发明的方法能够有效地确定出参类药材中具有药效的目标成分，并且确定了不同的制备方式对提取物浓度的影响及药效与剂量的关系，能够为临床精准用药及精准控制提供依据。以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12