微生物发酵生产乙醇中代谢物的高效液相检测方法与流程

本发明涉及工业发酵领域，具体涉及含co气体微生物发酵生产燃料乙醇中代谢物的高效液相检测方法。

背景技术：

含co气体微生物发酵生产乙醇过程中，发酵液中的乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇等发酵代谢物的含量对整个工艺控制有着极其重要的作用，含量过高或过低均会对最终产品的品质或菌体健康产生不良影响，目前，对于co气体微生物发酵生产乙醇中代谢物的检测，存在操作繁琐、难度大、准确率低的问题，因此，本领域亟需一种可以同时快速准确检测微生物发酵生产乙醇中产生的乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇含量的方法，以满足生产过程中质量控制的需要。

技术实现要素：

鉴于上述问题，提出了本发明以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的检测微生物发酵生产乙醇中代谢物的方法。

本发明实施例提供一种含co气体微生物发酵生产燃料乙醇中代谢物的高效液相检测方法，通过高效液相色谱分析，测定微生物发酵生产乙醇的发酵液中代谢物的含量，所述代谢物包括乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇，其特征在于，所述色谱条件为：

色谱柱：alltechioa-2000organicacid色谱柱；

流动相：硫酸浓度4-6mmol/l，溶剂为超纯水；

流速：0.5-1ml/min；

柱温：50-60℃；

检测器：rid；

运行时间：9-11min。

进一步地，所述色谱条件为：

色谱柱：alltechioa-2000organicacid色谱柱；

流动相：硫酸浓度5mmol/l，溶剂为超纯水；

流速：0.7ml/min；

柱温：55℃；

检测器：rid；

运行时间：10min。

进一步地，所述高效液相色谱分析中，进样体积为9-11μl。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

s1:配制标准溶液，所述标准溶液为乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的混合溶液；

s2:采用高效液相色谱仪，分别对各标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，并采用外标法分别绘制乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的含量-峰面积的标准曲线回归方程；

s3:采用与标准溶液完全相同的检测仪器和色谱条件，对待测含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液进行液相色谱分析，记录峰面积，根据步骤s2中的标准曲线回归方程计算得出所述含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液中乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的含量。

进一步地，所述标准溶液包括第一标准溶液和第二标准溶液，所述第一标准溶液由质量浓度分别为30g/l、5g/l、5g/l和10g/l的乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液混合而得，所述第二标准溶液由质量浓度分别为15g/l、2.5g/l、2.5g/l和5g/l的乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液混合而得；所述乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液的溶剂为超纯水。

进一步地，所述含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液的制备方法如下：

取待测微生物发酵生产乙醇的发酵液，加入5-磺酸水杨酸溶液，混匀后，获得混合溶液；

5-磺基水杨酸溶液配制方法为：将超纯水、浓硫酸和5磺基水杨酸混合均匀，获得5-磺基水杨酸溶液，所述超纯水、浓硫酸和5磺基水杨酸的体积质量比为250ml：13.89ml：5g；

将所述混合溶液进行离心操作，获得离心清液；所述离心清液为含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液。

进一步地，所述发酵液与5-磺酸水杨酸溶液的体积比为3-5：1。

进一步地，所述离心操作转速为12000-18000r/min。

进一步地，所述离心操作时间为≥3min。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1、本方法灵敏度高、准确度高、误差小，操作简单；

2、实现乙醇、乙酸、乳酸、2,3-丁二醇全部出峰，同时检测；

3、实现乙醇、乙酸、乳酸、2,3-丁二醇的有效分离，并峰形良好；

4、检测时间缩短，大大提高了生产效率。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考图形表示相同的部件。在附图中：

图1是本发明实施例1中的乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇检测结果图谱图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1

本申请提供一种微生物发酵生产乙醇中代谢物的高效液相检测方法，通过高效液相色谱分析，测定微生物发酵生产乙醇的发酵液中代谢物的含量，所述代谢物包括乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇中的至少一种，所述色谱条件为：

色谱柱：alltechioa-2000organicacid色谱柱；

流动相：硫酸浓度5mmol/l，溶剂为超纯水；

流速：0.7ml/min；

柱温：55℃；

检测器：rid；

运行时间：10min。

具体的，所述高效液相色谱分析中，进样体积为10μl。

具体的，所述方法包括如下步骤：

s1:配制标准溶液，所述标准溶液为乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的混合溶液；

s2:采用高效液相色谱仪，分别对各标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，并采用外标法分别绘制乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的含量-峰面积的标准曲线回归方程；

s3:采用与标准溶液完全相同的检测仪器和色谱条件，对待测含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液进行液相色谱分析，记录峰面积，根据步骤s2中的标准曲线回归方程计算得出所述含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液中乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的含量。

具体的，所述标准溶液包括第一标准溶液和第二标准溶液，所述第一标准溶液由质量浓度分别为30g/l、5g/l、5g/l和10g/l的乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液混合而得，所述第二标准溶液由质量浓度分别为15g/l、2.5g/l、2.5g/l和5g/l的乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液混合而得；所述乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液的溶剂为超纯水。

具体的，所述含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液的制备方法如下：

取待测微生物发酵生产乙醇的发酵液，置于离心管中，加入5-磺酸水杨酸溶液，混匀后，获得混合溶液；

将所述混合溶液进行离心操作，获得离心清液；所述离心清液为含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液。

具体的，所述发酵液与5-磺酸水杨酸溶液的体积比为4：1。

具体的，所述离心操作转速为15000r/min。

具体的，所述离心操作时间为3min。

下面将结合具体实施例对本申请的检测方法进行详细说明。

实施例2

一种含co气体微生物发酵生产燃料乙醇中代谢物的高效液相检测方法，通过高效液相色谱分析，测定微生物发酵生产乙醇的发酵液中代谢物的含量，所述代谢物包括乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇，其特征在于，所述色谱条件为：

色谱柱：alltechioa-2000organicacid色谱柱；

流动相：硫酸浓度4mmol/l，溶剂为超纯水；

流速：0.5ml/min；

柱温：50℃；

检测器：rid；

运行时间：9min。

具体的，所述高效液相色谱分析中，进样体积为9μl。

具体的，所述方法包括如下步骤：

s1:配制标准溶液，所述标准溶液为乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的混合溶液；

s2:采用高效液相色谱仪，分别对各标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，并采用外标法分别绘制乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的含量-峰面积的标准曲线回归方程；

s3:采用与标准溶液完全相同的检测仪器和色谱条件，对待测含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液进行液相色谱分析，记录峰面积，根据步骤s2中的标准曲线回归方程计算得出所述含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液中乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的含量。

具体的，所述标准溶液包括第一标准溶液和第二标准溶液，所述第一标准溶液由质量浓度分别为30g/l、5g/l、5g/l和10g/l的乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液混合而得，所述第二标准溶液由质量浓度分别为15g/l、2.5g/l、2.5g/l和5g/l的乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液混合而得；所述乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液的溶剂为超纯水。

具体的，所述含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液的制备方法如下：

取待测微生物发酵生产乙醇的发酵液，加入5-磺酸水杨酸溶液，混匀后，获得混合溶液；

5-磺基水杨酸溶液配制方法为：将超纯水、浓硫酸和5磺基水杨酸混合均匀，获得5-磺基水杨酸溶液，所述超纯水、浓硫酸和5磺基水杨酸的体积质量比为250ml：13.89ml：5g；

将所述混合溶液进行离心操作，获得离心清液；所述离心清液为含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液。

具体的，所述发酵液与5-磺酸水杨酸溶液的体积比为3：1。

具体的，所述离心操作转速为12000r/min。

具体的，所述离心操作时间为4min。

实施例3

一种含co气体微生物发酵生产燃料乙醇中代谢物的高效液相检测方法，通过高效液相色谱分析，测定微生物发酵生产乙醇的发酵液中代谢物的含量，所述代谢物包括乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇，其特征在于，所述色谱条件为：

色谱柱：alltechioa-2000organicacid色谱柱；

流动相：硫酸浓度6mmol/l，溶剂为超纯水；

流速：1ml/min；

柱温：60℃；

检测器：rid；

运行时间：11min。

具体的，所述高效液相色谱分析中，进样体积为11μl。

具体的，所述方法包括如下步骤：

s1:配制标准溶液，所述标准溶液为乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的混合溶液；

s2:采用高效液相色谱仪，分别对各标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，并采用外标法分别绘制乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的含量-峰面积的标准曲线回归方程；

s3:采用与标准溶液完全相同的检测仪器和色谱条件，对待测含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液进行液相色谱分析，记录峰面积，根据步骤s2中的标准曲线回归方程计算得出所述含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液中乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的含量。

具体的，所述标准溶液包括第一标准溶液和第二标准溶液，所述第一标准溶液由质量浓度分别为30g/l、5g/l、5g/l和10g/l的乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液混合而得，所述第二标准溶液由质量浓度分别为15g/l、2.5g/l、2.5g/l和5g/l的乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液混合而得；所述乙醇溶液、乙酸溶液、乳酸溶液和2,3-丁二醇溶液的溶剂为超纯水。

具体的，所述含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液的制备方法如下：

取待测微生物发酵生产乙醇的发酵液，加入5-磺酸水杨酸溶液，混匀后，获得混合溶液；

5-磺基水杨酸溶液配制方法为：将超纯水、浓硫酸和5磺基水杨酸混合均匀，获得5-磺基水杨酸溶液，所述超纯水、浓硫酸和5磺基水杨酸的体积质量比为250ml：13.89ml：5g；

将所述混合溶液进行离心操作，获得离心清液；所述离心清液为含有乙醇、乙酸、乳酸和2,3-丁二醇的溶液。

具体的，所述发酵液与5-磺酸水杨酸溶液的体积比为5：1。

具体的，所述离心操作转速为18000r/min。

具体的，所述离心操作时间为5min。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。