本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及启脾丸指纹图谱检测方法。
背景技术：
启脾丸由人参、白术、茯苓、甘草、陈皮、山药、莲子、山楂、六神曲、麦芽、泽泻等制成，具有健脾和胃之功效，主要用于脾胃虚弱，消化不良，腹胀便溏。制剂质量标准收载于2015版《中国药典》中。目前，启脾丸质量控制中有显微、薄层等定性鉴别，以及甘草的含量测定。现有质量标准指标对启脾丸质量监控较少，同时对生产过程中半成品药粉没有相关标准要求，从而导致该品种生产过程中不能全面监控质量，迫切需要一种在药品生产全过程中监控质量的方法。目前，原标准中尚无半成品及成品指纹图谱的检测，为了弥补上述不足，使其质量控制技术更加完善、科学，对启脾丸及其半成品指纹图谱进行研究，对连续十批的产品及半成品进行考察比较，建立该产品的指纹图谱hplc方法，并最终确定启脾丸成品及其半成品标准图谱，为提高启脾丸产品质量控制奠定基础。
中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱的研究和建立，对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要意义。
技术实现要素：
为克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种启脾丸及其半成品指纹图谱检测方法，通过实验方法研究，增加启脾丸半成品指纹图谱的测定方法，增强该产品有效性、质量可控性。
本发明的目的是通过下述技术方案来实现的：
一种启脾丸及其半成品指纹图谱的检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)启脾丸成品指纹图谱检测
(a)启脾丸供试品溶液的制备：取启脾丸适量，剪碎、精密称定，加入水饱和正丁醇、甲醇、乙醇或与磷酸水溶液混合一定比例的甲醇、乙醇中的一种溶剂提取，定容，过滤，滤液作为供试品溶液；
(b)启脾丸供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到启脾丸半成品的指纹图谱；
其中，高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相a为含有0.1％～1％磷酸的水溶液，流动相b为乙腈或乙腈和甲醇的混合溶液，流动相b中流动相a与流动相b的体积比随时间增加逐渐减少；检测波长为200～230nm。
上述高效液相色谱的检测波长优选203nm；色谱柱柱温为30～50℃，优选30℃；流动相a为含有0.1％～1％磷酸的水溶液，优选为流动相a中磷酸占0.4％；流动相b中乙腈与甲醇的体积比是100∶0～50∶50，优选为乙腈与甲醇的体积比是90∶10。
上述高效液相色谱梯度洗脱的程序如下，其中下述比例均为体积比：
0～9min时，流动相a∶流动相b＝90∶10～80∶20
9～35min时，流动相a∶流动相b＝75∶25～85∶15
35～55min时，流动相a∶流动相b＝81∶19～65∶35
55～70min时，流动相a∶流动相b＝75∶25～55∶45
70～105min时，流动相a∶流动相b＝65∶35～20∶80
105～135min时，流动相a∶流动相b＝30∶70～20∶80
优选下属的梯度洗脱的程序：
0min时，流动相a∶流动相b＝90∶10
9min时，流动相a∶流动相b＝81∶19
35min时，流动相a∶流动相b＝81∶19
55min时，流动相a∶流动相b＝71∶29
70min时，流动相a∶流动相b＝60∶40
105min时，流动相a∶流动相b＝25∶75
135min时，流动相a∶流动相b＝25∶75
(2)启脾丸半成品指纹图谱检测方法
(a)启脾丸半成品供试品溶液的制备：取启脾丸药粉适量，精密称定，加入水饱和正丁醇、甲醇、乙醇或与磷酸水溶液混合一定比例的甲醇、乙醇中的一种溶剂提取，定容，过滤，滤液作为供试品溶液；
(b)启脾丸半成品供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到启脾丸的指纹图谱；
其中，高效液相色谱的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相a为含有0.1％～1％磷酸的水溶液，流动相b为乙腈或乙腈和甲醇的混合溶液，流动相中流动相a与流动相b的体积比随时间增加逐渐减少；检测波长为200～230nm。
上述高效液相色谱的检测波长优选203nm；色谱柱柱温为30～50℃，优选30℃；流动相a为含有0.1％～1％磷酸的水溶液，优选为流动相a中磷酸占0.4％；流动相b中乙腈与甲醇的体积比是100∶0～50∶50，优选为乙腈与甲醇的体积比是90∶10。
上述高效液相色谱梯度洗脱的程序如下，其中下述比例均为体积比：
0～9min时，流动相a∶流动相b＝90∶10～80∶20
9～35min时，流动相a∶流动相b＝75∶25～85∶15
35～55min时，流动相a∶流动相b＝81∶19～65∶35
55～70min时，流动相a∶流动相b＝75∶25～55∶45
70～105min时，流动相a∶流动相b＝65∶35～20∶80
105～135min时，流动相a∶流动相b＝30∶70～20∶80
优选下属的梯度洗脱的程序：
0min时，流动相a∶流动相b＝90∶10
9min时，流动相a∶流动相b＝81∶19
35min时，流动相a∶流动相b＝81∶19
55min时，流动相a∶流动相b＝71∶29
70min时，流动相a∶流动相b＝60∶40
105min时，流动相a∶流动相b＝25∶75
135min时，流动相a∶流动相b＝25∶75
本发明提供了一种启脾丸成品及其半成品的指纹图谱测定方法。本发明是在大量实验基础上所得到的切实可行的办法，具有可重复性。在本发明中，通过高效液相色谱法，在相同的测试条件下多次获取的启脾丸成品制剂的高效液相指纹图谱基本相同，说明重复性好。因此可通过将上述测定方法获得的多批次的启脾丸成品指纹图谱应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成对照指纹图谱作为制剂的标准指纹图谱。启脾丸半成品的指纹图谱通过类似方法生成对照指纹图谱作为半成品的标准指纹图谱，上述测定方法可以定入启脾丸的质量控制标准，该方法能够客观的反应产品内在成分的变化，可以较为全面地控制产品的质量。
本发明具有如下优点：
(1)建立的启脾丸成品标准指纹图谱及其半成品标准指纹图谱能有效的表征启脾丸制剂的质量，通过对启脾丸各批成品制剂的指纹图谱进行相似度评价，从而对各批次成品中多种化学成分进行控制，从整体上、宏观上控制启脾丸制剂的产品质量。
(2)以启脾丸中各成分指纹图谱作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和互相关系，注重整体面貌特征。本发明为完整、准确评价启脾丸制剂的质量提供了新的对照标准，将为提高启脾丸制剂的质量及疗效控制提供参考依据。
(3)本发明方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。
(4)可用于生产工艺稳定性和产品稳定性的考察，有利于对制剂的质量进行全方面监控。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
比较实施例1
1.仪器与试剂
仪器：采用岛津lc-20a高效液相色谱仪，包括四元泵，在线脱气装置，自动进样器，lc-solution工作站；乙醇、乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸、正丁醇为分析纯，哇哈哈纯净水；15批启脾丸药粉；15批启脾丸成品制剂。
2.色谱条件
岛津技尔c18柱(250mm*4.6mm*5μm)；柱温30℃；流速1ml/min；流动相a为0.4％磷酸水溶液；流动相b为乙腈∶甲醇(90∶10)，波长：203nm，梯度洗脱，洗脱程序为：
0min时，流动相a∶流动相b＝90∶10
9min时，流动相a∶流动相b＝81∶19
35min时，流动相a∶流动相b＝81∶19
55min时，流动相a∶流动相b＝71∶29
70min时，流动相a∶流动相b＝60∶40
105min时，流动相a∶流动相b＝25∶75
135min时，流动相a∶流动相b＝25∶75
3.标准指纹图谱的建立
3.1供试品溶液的制备：
3.1.1启脾丸半成品溶液的制备；分别取启脾丸10个批次药粉8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，称重，超声提取1h，放凉，补重，过滤，即得。
3.1.2启脾丸成品溶液的制备：分别取启脾丸10个批次，剪碎，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，称重，超声提取1h，放凉，补重，过滤，即得。
3.2测定法：分别吸取上述供试液10μl注入液相色谱仪测定，记录150min的色谱图。构建标准指纹图谱：按上述方法，对启脾丸10个批次半成品、成品分别进行测定，分别找出其共有特征峰，经软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》拟合，建立各自的hplc对照指纹图谱。
3.3方法学考察
3.3.1精密度考察
分别以同一批启脾丸成品制剂供试品溶液，连续进样6次，考察仪器的精密度。所获得的6份指纹图谱分别与3.2.1中建立的该成品标准指纹图谱比较，采用软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算相似度，6份指纹图谱的相似度rsd(％)值为0.815％。结果表明精密度良好。
3.3.2溶液稳定性考察
分别以同一批启脾丸成品制剂供试品溶液，在0小时，4小时，8小时，12小时，24小时，48小时进样，考察样品稳定性。考察指标同精密度，相似度rsd(％)值为1.224％。结果表明供试液在48小时内稳定。
3.3.3重复性考察
取同一批启脾丸制剂6份，按照样品制备方法“3.1.2”项下方法进行提取，测定，所获得的6份指纹图谱分别与3.2.1中建立的该成品标准指纹图谱比较，采用软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算相似度，6份指纹图谱的相似度rsd(％)值为1.472％。结果表明此方法重复性良好。
4.测定启脾丸制剂、半成品
4.1按照所述检测方法和条件分别测定5批启脾丸半成品(除已经采用的10批以外)，采集150min色谱图，即为这5批待测半成品指纹图谱。
4.2按照所述检测方法和条件分别测定5批启脾丸成品制剂(除已经采用的10批以外)，采集150min色谱图，即为这5批待测制剂指纹图谱。
5.测定结果
5.1将5批启脾丸半成品的指纹图谱与3.2.2中建立的该半成品标准指纹图谱比较，采用软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算整体相似度，结果相似度分别为0.985、0.984、0.998、0.991、0.993。5批半成品与标准指纹图谱的相似度大于0.90，可以进入下一步工序。
5.2将5批启脾丸成品制剂的指纹图谱与3.2.1中建立的该成品标准指纹图谱比较，采用软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算整体相似度，结果相似度分别为0.997、0.999、0.998、0.999、0.994。5批半成品与标准指纹图谱的相似度大于0.90，可以作为合格品出厂。