一种基于AuPB@AuNPs荧光检测酪氨酸酶的方法与流程

本发明涉及一种基于au^pb@aunps荧光检测酪氨酸酶的方法，属于分析检测的技术领域。

背景技术：

酪氨酸酶也叫做多酚氧化酶、儿茶酚氧化酶，是一种含有二价铜离子的金属酶，能够催化苯酚衍生物羟基化为儿茶酚衍生物，并经过进一步氧化得到具有邻苯二醌结构的产物，它既具有单酚酶的活性，也具有二酚酶的活性。同时，酪氨酸酶在人体黑色素的形成以及果蔬酶促褐变中起到了十分关键的作用，是黑色素的生物在合成过程中的关键限速酶。酪氨酸酶与雀斑和老年斑等一些色素沉着性的疾病有着重要的关系。最近，有报道称酪氨酸酶与帕金森病等相关神经变性疾病有关,并且酪氨酸酶的过度表达更容易导致黑色素瘤的产生。另外，它的代谢紊乱也极易引发某些皮肤疾病，如常见的白癜风等。酪氨酸酶抑制剂能够用于医药、化妆品、农业及食品工业等众多领域，因此研究一种快速、成本低、简便、有效、灵敏地检测酪氨酸酶的方法是十分重要的。

目前，用于检测酪氨酸酶的方法有很多种。酶促反应动力学研究酪氨酸酶酶活性的方法具有着一定的局限性，虽然其生成的产物在该条件下能够被酪氨酸酶氧化，但准确性较差。中国专利号（cn10285423313b）公开了一种基于修饰电极的酪氨酸酶生物传感器及其制备方法，电化学法检测酪氨酸酶，运用了酪氨酸酶可以氧化苯酚化合物成为邻苯二醌这一特点，并且酶的含量通过电信号进行表现，但其灵敏度不高、易受到环境的干扰，检测的重现性较差，基于抗原抗体的反应所建立的检测酪氨酸酶方法，因其价格昂贵，只能定性或半定量的检测酪氨酸酶含量。因此我们需要开发一种定量检测酪氨酸酶的方法。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种基于au^pb@aunps荧光检测酪氨酸酶的方法。首先将au^pb@aunps功能化变成aupb@au-fe（nta）nps，酪氨酸酶催化氧化多巴胺为多巴醌，体系中多巴胺的含量降低，荧光减弱。近年来，荧光光谱被认为是快速、定量检测分析物的可靠方法。利用酪氨酸酶催化氧化多巴胺后所生成的多巴醌不能与au^pb@aunps-fe(nta)形成络合物，荧光强度减弱，从而制备荧光基底间接地检测酪氨酸酶的活性，该方法能实现酪氨酸酶的定量检测，操作简单方便。

本发明的技术方案如下：

一种基于au^pb@aunps荧光检测酪氨酸酶的方法，包括以下步骤：

s1、制备au^pb@aunps基底；

s2、制备不同浓度的酪氨酸酶标准溶液，加入多巴胺进行共培养，接着加入au^pb@aunps基底混匀后，得au^pb@aunps荧光检测基底；

s3、将步骤s2制备的au^pb@aunps荧光检测基底进行荧光光谱检测；记录在318nm处的荧光强度，酪氨酸酶活性为横坐标作出相对应的荧光工作曲线；

s4、将待测物质进行荧光光谱检测后，并通过荧光工作曲线计算出待测物质中酪氨酸酶的浓度。

进一步的，所述工作曲线为y=−10.93x+5183，其中y为318nm处的荧光强度；x为酪氨酸酶的浓度，r²=0.981。

进一步的，步骤s2的具体步骤为：将多巴胺溶液与等体积的酪氨酸酶标准溶液混合的标准混合溶液，接着将au^pb@au-fe(nta)溶液和等体积的标准混合溶液混合，在室温下，轻微振荡3min，使溶液分散均匀，得au^pb@aunps荧光检测基底。

进一步的，所述au^pb@aunps基底的制备方法如下：

（1）au^pb@aunps的合成

取10ml纳米金胶溶液，加入10-20μl浓度为0.1mol/l的普鲁士蓝溶液作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，重新悬浮于10ml超纯水中，得au@pb胶体；往10ml的制备好的au@pb胶体中加入250μl浓度为6*10^-2mol/l的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入2.5ml浓度为1mmol/l氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，重新分散于5ml超纯水中，得到au^pb@au胶体；

（2）fe（nta）溶液的合成

首先取浓度为10⁻³m的九水硝酸铁溶液和浓度为10⁻³m的氨三乙酸三钠溶液按体积1:1混合后，往溶液中添加ph调节剂调节fe（nta）溶液的ph为7.0，混合液静置，得fe（nta）溶液；

（3）au^pb@aunps荧光检测基底的制备

将步骤（1）制备好的au^pb@au胶体与步骤（2）制备的fe（nta）溶液按体积1:1混合后，搅拌混合后，离心洗涤除去未反应的fe（nta），去除上清液，剩下au^pb@au-fe(nta)胶体备用，即为荧光检测探针。

进一步的，所述纳米金胶溶液的制备方法如下：取100ml质量分数为0.01%的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1-1.5ml质量分数为1%柠檬酸钠溶液，加入到沸腾的上述氯金酸溶液中，待沸腾15min后，反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶。

进一步的，所述步骤（2）的ph调节剂为浓度为0.1mol/l的氢氧化钠溶液。

进一步的，步骤（3）的搅拌时间为至少30min。

进一步的，步骤s2中所述多巴胺溶液和酪氨酸酶标准溶液使用浓度均为500μl。

进一步的，所述多巴胺溶液的浓度为10^-3m。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供的一种基于au^pb@aunps荧光检测酪氨酸酶的方法，通过制备au^pb@aunps作为荧光检测的探针，au^pb@aunps比传统的aunps溶液更稳定，不易变质，便于保存备用

2、本发明提供的一种基于au^pb@aunps荧光检测酪氨酸酶的方法，具有快速响应、定量检测的优点。

3、本发明公开了一种基于au^pb@aunps荧光检测酪氨酸酶的方法，该检测方法利用硝酸铁溶液与氨三乙酸三钠发生螯合反应制备fe(nta)标签修饰的au^pb@au-fe(nta)nps对酪氨酸酶进行了荧光检测。实验发现，修饰于核壳纳米表面的fe(nta)的羟基基团能与多巴胺的酚羟基形成络合物fe(nta)da，荧光增强；当体系中出现酪氨酸酶（tyr）时，催化氧化多巴胺变成成多巴醌时，荧光减弱。据此构建了au^pb@aunps荧光传感器，与不同浓度的酪氨酸酶建立标准曲线。通过本发明，使用荧光法检测酪氨酸酶，提高了检测体系的稳定性和准确性，实现了原位定量检测。

附图说明

图1为本发明的实施例1的一种基于au^pb@aunps荧光检测酪氨酸酶的方法的流程图；

图2是实施例2中au^pb@aunps-fe(nta)da，au^pb@aunps-fe(nta)，au^pb@aunpsfe(nta)da+tyr(500u/ml)，au^pb@aunps的荧光光谱图；

图3是实施例2中不同时间318nm处的荧光强度随时间变化的关系图；

图4是实施例2中加入不同浓度酪氨酸酶后的荧光发射光谱图；

图5是是实施例2中不同酪氨酸酶浓度与318nm处的荧光强度的线性关系图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1

（1）au^pb@aunps的合成

取100ml质量分数为0.01%的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1.5ml质量分数为1%柠檬酸钠溶液，加入到沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾15min后，反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶；取10ml纳米金胶溶液，加入20μl浓度为0.1mol/l的普鲁士蓝（pb）溶液作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，目的是为了洗去未吸附在纳米金胶上的普鲁士蓝溶液，重新悬浮于10ml超纯水中，得au@pb胶体；往10ml的制备好的au@pb胶体中加入250μl浓度为6*10^-2mol/l的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入2.5ml浓度为1mmol/l氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，重新分散于5ml超纯水中，得到au^pb@au胶体；

（2）au^pb@au-fe(nta)nps的合成

首先取3ml九水硝酸铁溶液fe(no3)3.9h2o(10⁻³m)和3ml氨三乙酸三钠nta(10⁻³m)溶液按体积1:1混合后,往溶液中添加(200μl,0.1mol/l)氢氧化钠溶液调节fe（nta）溶液的ph为7.0，混合液静置15min备用。将步骤（1）制备好的au^pb@au胶体与fe（nta）溶液按体积1:1混合后，混合液磁力搅拌30min，反应结束后离心洗涤除去未反应的fe（nta），去除上清液，au^pb@au-fe(nta)nps重新分散备用。

（3）荧光光谱法检测酪氨酸酶

500μl10^-3m多巴胺与50μl不同浓度（300、200、100、50、15u/ml）的酪氨酸酶溶液混合反应15min，取500μl步骤（2）制备好的au^pb@au-fe(nta)nps与500μl（da与tyr）的反应产物混合均匀后，利用荧光分光光度计检测光谱的强度。

实施例2

本实施例对本发明的一种基于au^pb@aunps的荧光光谱法检测酪氨酸酶进行详细描述，流程图如图1所示，其包括以下步骤：

（1）au^pb@aunps的合成

取100ml质量分数为0.01%的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取1.5ml质量分数为1%柠檬酸钠溶液，加入到沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾15min后，反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶；取10ml纳米金胶溶液，加入10μl浓度为0.1mol/l的普鲁士蓝（pb）溶液作为拉曼信号分子，搅拌混合均匀后离心，目的是为了洗去未吸附在纳米金胶上的普鲁士蓝溶液，重新悬浮于10ml超纯水中，得au@pb胶体；往10ml的制备好的au@pb胶体中加入250μl浓度为6*10^-2mol/l的柠檬酸钠溶液，磁力搅拌加热至沸腾后，加入2.5ml浓度为1mmol/l氯金酸溶液后停止加热，继续磁力搅拌1h后，将胶体离心洗涤2次，重新分散于5ml超纯水中，得到au^pb@au胶体；

（2）au^pb@au-fe(nta)nps的合成

首先取3ml九水硝酸铁溶液fe(no3)3.9h2o(10⁻³m)和3ml氨三乙酸三钠nta(10⁻³m)溶液按体积1:1混合后,往溶液中添加(200μl,0.1mol/l)氢氧化钠溶液调节fe（nta）溶液的ph为7.0，混合液静置15min备用。将步骤（1）制备好的au^pb@au胶体与fe（nta）溶液按体积1:1混合后，混合液磁力搅拌30min，反应结束后离心洗涤除去未反应的fe（nta），去除上清液，au^pb@au-fe(nta)nps重新分散备用。

（3）荧光光谱法检测酪氨酸酶

500μl10^-3m多巴胺与50μl不同浓度（300、200、100、50、15u/ml）的酪氨酸酶溶液混合反应3min，取500μl步骤（2）制备好的au^pb@au-fe(nta)nps与500μl（da与tyr）的反应产物混合均匀后，利用荧光分光光度计检测光谱的强度。

1、荧光法酪氨酸酶检测的可行性分析

为了证明该方法的可行性，采用实施例1的方法首先检测了au^pb@aunps-fe(nta)da，au^pb@aunps-fe(nta)-da+tyr(500u/ml)，au^pb@aunps-fe(nta)，au^pb@aunps的荧光光谱图如图2所示，au^pb@aunps和au^pb@aunps-fe(nta)均无荧光信号，当和溶液中的多巴胺络合形成fe(nta)da的时候，荧光增强，当出现酪氨酸酶的活性为500u/ml的时候，318nm处的荧光强度减弱，这是因为酪氨酸酶将体系中的多巴胺氧化成多巴醌，导致多巴胺的量降低，说明该方法可以用于酪氨酸酶的检测；

2、最佳反应时间的测试

au^pb@au-fe(nta)nps和混合溶液（酪氨酸酶加多巴胺）的混合时间会影响荧光响应。测试时间从3min-20min,图3是不同时间318nm处的荧光强度随时间变化的关系图。从图中可以看出荧光强度随时间增加呈现递减的趋势，在15min左右出现稍微缓和的趋势，所以可以把时间定在15min左右，因为前15min递减的趋势太快了，说明反应体系还未稳定。

3、酪氨酸酶标准曲线的测定

图4加入不同浓度酪氨酸酶（300、200、100、50、15u/ml）后的荧光发射光谱图。图5是不同酪氨酸酶浓度与318nm处的荧光强度的线性关系图，溶液在318nm处的荧光强度随着酪氨酸酶浓度在15-300u/ml之间而降低,荧光强度与酪氨酸酶活性之间存在良好线性关系，拟合的线性方程可表示为y=-10.93x+5183，x为酪氨酸酶的浓度，r²=0.981。这是因为生物探针中多巴胺的含量高时，荧光强度增加，当酪氨酸酶浓度增加的时候，体系中多巴胺的含量降低，荧光减弱。