一种利用荧光宽场成像的轨迹光强分布获取剪切场下微观运动信息的方法与流程

本发明属于高分子物理领域，涉及一种利用荧光宽场成像的轨迹光强分布获取剪切场下微观运动信息的方法。

背景技术：

在高分子物理基础研究领域，对剪切流场特性以及剪切场下分子、颗粒、高分子链如多电荷软物质所表现出的流变学性质及与微观运动、结构的关联性一直是学术界、工业界的热点研究，同时也是难点课题。这方面研究不仅有助于更好地理解流动场下的微观物理过程，同时对于生物领域研究以及高端微流控装置的设计、制造也有重要的指导意义。

传统剪切流场下的测量通常采用接触式或取样式，不仅无法获详细的取流场内部实时信息，同时会对流场造成干扰，导致测量结果可信度不高。基于激光技术的非接触测量方法具有对流场无干扰、可实时原位测量和高时空分辨率等优势。随着现代激光技术和荧光光谱、图像信息采集硬件和技术的快速发展，具有广阔的应用前景。对于外加剪切场下的运动，阿姆斯特丹大学的danielbon等利用共聚焦显微镜与流变学相结合的方法，测定了简单屈服流体的流速分布(falla,paredesj,bonnd.yieldingandshearbandinginsoftglassymaterials.physicalreviewletters.2010nov23；105(22):225502.)；为从微观的分子细节层面上获得流变过程中单分子(单粒子)的运动信息，并将之与宏观流变学性质参数直接关联，中国科学院化学研究所赵江等将高分辨、高灵敏的单分子荧光光谱技术与商业化旋转流变仪相结合，开发出高分子显微流变光谱仪，实现了能够同步测量高分子等软物质体系宏观流变学性质和其微观结构特征参数(cn105675560b一种获取剪切场下单个聚合物分子荧光发射光谱信息的方法)；并利用荧光涨落关联光谱的方法成功获得了荧光标记聚合物分子在高剪切速率下的高速运动信息，具体值在6000-18000μm/s范围(cn201610031737.9a一种获取剪切场下单个聚合物分子扩散以及定向运动信息的方法)。

然而，由于荧光关联光谱方法并不能直接获取真实的微观图像，并具有拟合模型依赖性：一方面，在低速流场下，稳态剪切导致的流动特征时间与荧光探针自身扩散特征时间相近时，模型难以得到低速稳态剪切场下的运动信息；另一方面，难以通过模型拟合获取更常见的复杂剪切方式如震荡剪切下的微观运动状态和信息。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用荧光宽场成像的轨迹光强分布获取剪切场下微观运动信息的方法。该方法既可以实施精确的剪切场，而且具有极高的分辨率和灵敏度，并可以同过成像轨迹分析直接获得运动状态和参数。

本发明提供的获取剪切场下微观运动信息的方法，包括：将待测样品a或待测样品b利用荧光宽场成像获得的轨迹信息进行数据处理，得到所述待测样品在剪切场下的微观运动信息。

上述方法中，所述待测样品a为荧光标记的待测样品c；

所述待测样品c为本身不能产生荧光的物质；具体选自二氧化硅、聚苯乙烯微球和聚合物链中至少一种；所述聚合物链具体选自聚苯乙烯磺酸钠、聚环氧乙烷和聚苯乙烯中至少一种；

所述待测样品b为本身能产生荧光的物质；具体选自染料分子；更具体选自罗丹明6g、alexa633nhs、fitcisothiocyanate和atto620中至少一种。

具体的，所述将所述待测样品a或待测样品b利用荧光宽场成像获得轨迹信息的方法包括：

1)配置稀溶液；

所述稀溶液由所述待测样品a或待测样品b和溶剂组成；

2)对步骤1)所得稀溶液施加剪切场，在所述施加剪切场的同时，将激光通过光学系统照射于所述稀溶液上，选择成像模式进行实时成像，得到所述待测样品的轨迹光强分布。

上述方法的所述步骤1)中，所述稀溶液的浓度小于10nm；具体为5nm；

所述溶剂选自水、甘油、乙醇和十四烷中至少一种；

所述荧光的激发光波长具体为532nm。

所述荧光标记的方法为化学反应键合；

所述荧光标记的位置为待测样品粒子表面或内部；

所述荧光标记所用荧光分子为荧光染料；具体选自罗丹明6g、alexa633nhs、fitcisothiocyanate和atto620中至少一种；

所述罗丹明6g的结构式如式i所示：

所述方法还可包括：在所述荧光标记步骤前，对荧光标记所用荧光分子进行酸化水解。

所述方法在所述标记之后还包括除去残留未标记的荧光染料的步骤，如通过过超滤膜以及离心等分离方法。

所述步骤2)中，所述剪切场由能够实施精确外加剪切的流变仪所施加；所述流变仪具体为旋转流变仪；

所述成像模式选自全内返射模式、倾斜角出射模式和垂直出射模式中至少一种；

所述光学系统中，激发光光学窗口具体为石英载玻片；所述石英载玻片的厚度具体为0.13～0.17mm；从而使光学窗口具有高透过率和短工作距离；

所用光学成像硬件平台为光学显微镜；

所用成像单元为具有足够高量子效率及较大增益的芯片放大emccd相机；

所述激光是由激光器产生的；所述激光器可为连续激光或者飞秒脉冲激光，目的是激发更多种荧光分子，所选择激光器的波长需要与所激发的荧光探针相匹配；从所述激光器发射的激光分别依次分别经若干反射镜反射或透射和所述光阑并依次经第一扩束镜和第二扩束镜进行两级扩束将激光光束直径扩大到2.0cm左右以确保其尺寸大于光学显微单元的显微镜物镜进光孔。

所述轨迹信息选自轨迹长度、光强和曝光时间中至少一种。

具体的，所述数据处理包括：

3)通过单个粒子轨迹光强累积的起始坐标(x0,y0)和终点坐标(x1,y1)，确定光强累积基线，其对应的方程的斜率k1＝(y1-y0)/(x1-x0)；

则垂直于基线方向的光强累积线对应的方程的斜率为k2＝-1/k1；

所述光强累积过程中，所选步长e和步数n能够覆盖整个所述单个粒子的轨迹区域；

4)将步骤3)所述光强累积线所穿过的所有像素点的光强值进行代数加和，得到所述待测样品a或待测样品b粒子运动轨迹上光强分布图；

所述光强分布图中，横坐标为步数n；纵坐标为每个步长上所有像素点的光强值的代数加和；

若所述光强分布图中显示光强均匀分布，则证明剪切模式为稳态剪切，流动状态为简单层流；

粒子的运动速度v由v＝dphy/tex计算而得：

其中，所述dphy为粒子光强轨迹实际对应的物理尺寸；

tex为已知实时成像的曝光时间；

若所述光强分布图中显示光强不均匀分布，出现拖尾，则证明剪切模式为非稳态剪切。

上述数据处理方法中，所述非稳态剪切为震荡剪切；

所述光强累积基线的长度d由步长e与步数n的乘积确定或由终止点(x1,y1)和起始点坐标(x0,y0)确定；

所述光强累积基线和所述光强累积线之间的宽度w值需要能覆盖粒子的整个轨迹区域；

所述dphy由emccd中像素点对应的实际物理尺寸与轨迹包含的像素点数的乘积而得。考虑像素点具有实际物理尺寸，累积过程误差可通过光强累积线所切割区域面积的阈值error进行设置，累积过程将忽略图2中s1面积小于error值的像素点；所述阈值error具体为0-0.5

上述方法中，所述方程和计算均可通过使用公知常用的matlab和originlab等软件处理获得。

上述方法所用可在剪切场下进行原位荧光宽场成像的测量系统为高分子显微流变光谱仪，其具体结构如图1所示，包括激发模块1、剪切施加与流变测量模块2、光学显微单模块：单分子荧光成像单元emccd相机14和/或光谱测量单元13，和/或荧光关联光谱测量单元12，剪切施加与流变测量单元2底部的下基板设置激发光光学窗口；

激发光源发出的激发光照射待测样品，待测样品为聚合物分子和/或胶体粒子，染料分子以化学键合的方式接到聚合物分子链上以及胶体粒子表面或内部；剪切施加与流变测量模块2用于对待测样品施加精确剪切场；激光光源模块1出射的激发光通过光学窗口5引入到位于剪流场下的样品，使得待测样品中的染料分子受到激发产生荧光信号，并将产生的荧光信号收集分别发射到单分子荧光成像单元14、单分子荧光发射光谱测量单元13和/或荧光关联光谱测量单元12；单分子荧光成像单元14用于对运动速度较慢体系内的单个荧光分子进行实时荧光成像，获得体系中的单分子实空间运动信息，即获取该荧光分子的定向运动速度和运动状态信息；

优选地，剪切施加与流变测量模块2采用能够实施精确剪切的旋转流变仪，下基板设置有一高透过率且短工作距离的激发光光学窗口，具体可为厚度为0.13～0.17mm的石英载玻片，较短工作距离可以保证与高数值孔径的显微镜水或油浸物镜相匹配，具有不超过0.2mm的工作距离。

优选地，激发光源模块1可以采用连续激光或飞秒脉冲激光，目的是激发更多种不同性质的荧光分子，所选择激光器的波长需要与所激发的染料分子相匹配，本实施例中的激发光源模块1包括三种不同波长的激光器(以此为例，但是不限于此，可以根据实际使用进行选择)，如三个激光器的波长分别可为647nm、532nm和473nm。

优选地，单分子荧光成像单元14可以采用具有足够高量子效率及较大增益的芯片放大emccd相机。

优选地，该系统还搭载一现有技术的高精度位移平台，需要时可以将旋转流变仪放置在显微镜物镜3的上方，从而保证各个器件的精确联动。

利用上述高分子显微流变光谱仪进行成像的具体操作可为：

a、打开激发光源(532nm)并将扩束后的激发光束调节准直使之成为平行光束,并进入显微镜后镜筒透镜，在镜头处再次平行出射；

b、将流变仪通过高精度位移台移动到显微镜物镜正上方；

c、对流变仪进行校零；

d、切换到水浸物镜，并在显微镜物镜上加入40μl超纯水，并向上调节使之达到合适的聚焦位置；

e、加样品于载玻片正中心；

f、将流变仪转子移至测试位置，打开流变仪控制软件实施稳态剪切测试方法；

g、打开荧光成像单元进行原位成像。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供的测量方法，采用高分子流变显微光谱仪，将宏观的剪切施加与流变测量技术与单分子荧光成像技术相结合。此方法具有单分子级别的灵敏度，测量样品的浓度可达到nm量级。通过实现对样品施加稳态剪切以及宽频率范围、具有不同幅度、不同频率的振荡剪切，可以对被施加剪切力场的样品进行原位的单分子荧光显微成像观察：在单分子水平上直接观察样品中单个荧光探针分子(或荧光颗粒)的运动，并获得和分析单分子尺度下的运动信息。

附图说明

图1为本发明所用的实验装置“高分子显微流变光谱仪”的示意图；

各标记如下：1.激发光光源，2.剪切施加与流变测量模块，3显微镜物镜，4.二向色镜，5.石英载玻片，6.样品，7.滤光片，8.聚焦透镜，9.针孔，10.扩束镜，11.反射镜，12.单光子探测器，13.单分子荧光光谱仪，14.emccd相机，15.光阑。

图2为对轨迹光强进行累积处理以获得光强分布的机理示意图。

图3为低剪切速率(0.1s^-1)的稳态剪切场下，获取的微观尺度下的粒子运动轨迹。

图4为低剪切速率(0.1s^-1)的稳态剪切场下，对获取的运动轨迹进行图像处理和获取光强分布。

图5为震荡剪切场下，获取的微观尺度下的粒子运动轨迹。

图6为震荡剪切场下，对获取的运动轨迹进行图像处理和获取光强分布。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。罗丹明6g，99％，分析纯，购于西格玛试剂公司。

本发明方法所用可在剪切场下进行原位荧光宽场成像的测量系统为高分子显微流变光谱仪，其具体结构如图1所示，包括激发模块1、剪切施加与流变测量模块2、光学显微单模块：单分子荧光成像单元emccd相机14和/或光谱测量单元13，和/或荧光关联光谱测量单元12，剪切施加与流变测量单元2底部的下基板设置激发光光学窗口；

激发光源发出的激发光照射待测样品，待测样品为聚合物分子和/或胶体粒子，染料分子以化学键合的方式接到聚合物分子链上以及胶体粒子表面或内部；剪切施加与流变测量模块2用于对待测样品施加精确剪切场；激光光源模块1出射的激发光通过光学窗口5引入到位于剪流场下的样品，使得待测样品中的染料分子受到激发产生荧光信号，并将产生的荧光信号收集分别发射到单分子荧光成像单元14、单分子荧光发射光谱测量单元13和/或荧光关联光谱测量单元12；单分子荧光成像单元14用于对运动速度较慢体系内的单个荧光分子进行实时荧光成像，获得体系中的单分子实空间运动信息，即获取该荧光分子的定向运动速度和运动状态信息；

优选地，剪切施加与流变测量模块2采用能够实施精确剪切的旋转流变仪，下基板设置有一高透过率且短工作距离的激发光光学窗口，具体可为厚度为0.13～0.17mm的石英载玻片，较短工作距离可以保证与高数值孔径的显微镜水或油浸物镜相匹配，具有不超过0.2mm的工作距离。

优选地，激发光源模块1可以采用连续激光或飞秒脉冲激光，目的是激发更多种不同性质的荧光分子，所选择激光器的波长需要与所激发的染料分子相匹配，本实施例中的激发光源模块1包括三种不同波长的激光器(以此为例，但是不限于此，可以根据实际使用进行选择)，如三个激光器的波长分别可为647nm、532nm和473nm。

优选地，单分子荧光成像单元14可以采用具有足够高量子效率及较大增益的芯片放大emccd相机。

优选地，该系统还搭载一现有技术的高精度位移平台，需要时可以将旋转流变仪放置在显微镜物镜3的上方，从而保证各个器件的精确联动。

实施例1、剪切场下利用荧光成像轨迹获得荧光标记粒子在水和甘油的混合体系中的运动信息。

1)荧光标记粒子的制备：

将待标记粒子二氧化硅分散于乙醇中，加入千分之一体积分数的(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，并加入少量氨水催化反应，室温反应18小时；

将上述产物与羧基化后的罗丹明6g染料进一步反应，以4-(dimethylamino)pyridine(alfaaesar,99％)作为催化剂，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride(acrosorganics,98％)作为脱水剂，使氨基与羧基充分反应，将染料分子通过化学方法键合至粒子表面；

将反应后的粒子分散液用水和乙醇各清洗三次，离心分离产品，以移除自由染料分子，得到罗丹明6g染料标记的二氧化硅粒子；

将罗丹明6g染料标记的二氧化硅粒子分散于水和甘油(体积比4:1)组成的混合体系中得到稀溶液，使其浓度为5nm；

2)稳态剪切场下运动信息的获取

操作步骤如下：

打开激发光源(532nm)并将扩束后的激发光束调节准直使之成为平行光束，并进入显微镜后镜筒透镜，在镜头处再次平行出射；

将流变仪通过高精度位移台移动到显微镜物镜正上方；

对流变仪进行校零；

切换到水浸物镜，并在显微镜物镜上加入40μl超纯水，并向上调节使之达到合适的聚焦位置；

加样品于载玻片正中心；

将流变仪转子移至测试位置，打开流变仪控制软件实施稳态剪切测试方法；

打开荧光成像单元进行原位成像，单分子尺度下的运动轨迹如图3所示。emccd相机每个像素点对应的真实物理尺寸为0.267μm，曝光时间tex＝0.2s。如图4中a所示，累积初始坐标(219,449)，累积方向宽度w＝5，步数n＝350,步长e＝0.1软件获取基线累积长度d＝n×e＝35足够覆盖整个粒子光强区域，阈值error设为0。图4中b累积得到的轨迹光强分布显示其光强均匀分布，粒子为匀速运动，证明此时剪切模式为稳态剪切，流动状态为简单层流。累积长度中粒子轨迹对应的实际物理尺寸dphy＝4.92μm，计算得到微观尺度下的运动速度v＝dphy/t，具体计算结果为v＝24.6μm/s。

震荡剪切下运动信息的获取

打开激发光源(532nm)并将扩束后的激发光束调节准直使之成为平行光束,并进入显微镜后镜筒透镜，在镜头处再次平行出射；

将流变仪通过高精度位移台移动到显微镜物镜正上方；

对流变仪进行校零；

切换到水浸物镜，并在显微镜物镜上加入40μl超纯水，并向上调节使之达到合适的聚焦位置；

加样品于载玻片正中心；

将流变仪转子移至测试位置，打开流变仪控制软件实施震荡剪切测试方法；

打开荧光成像单元进行原位实时成像，单分子尺度下的运动轨迹如图5所示。

对图6中a所示的轨迹光强进行光强累积，初始坐标为(354,367)，终点坐标(376,393)，宽度w＝5，阈值error设为0。图6中b结果显示光强分布不均匀，光强累积值在最大振幅处最大，在平衡位置最小，证明此时剪切模式为震荡剪切。