一种检测PCA3的壳聚糖级联双环谐振腔芯片的制备方法与流程

本发明涉及级联双环谐振腔传感技术领域，具体涉及一种检测pca3的壳聚糖级联双环谐振腔芯片的制备方法。

背景技术：

目前，前列腺癌已经成为危害男性健康的主要恶性肿瘤之一。在欧美国家，前列腺癌的发病率已连续多年居男性恶性肿瘤发病率首位。在我国，前列腺癌发病率也呈逐年上升趋势。前列腺穿刺活检psa是诊断前列腺癌的金标准，但是作为侵入性检查方式，穿刺活检存在感染和出血等风险。而且，由于psa具有前列腺组织特异性，却没有肿瘤特异性，在某些良性前列腺疾病中亦有增高，前列腺穿刺活检psa存在对低风险前列腺癌的过度诊断和高级别前列腺癌的诊断不足的缺点。

前列腺癌基因3(prostatecancergene3，pca3)是一种在前列腺癌组织中高表达的非编码rna，不仅具有器官(前列腺)特异性，还具有肿瘤特异性，对前列腺癌检测具有高度特异性，可反应前列腺癌进展情况，是目前已知的诊断前列腺癌的重要的生物学标志物之一。只需对尿液细胞中的pca3基因表达量进行检测，就能实现前列腺癌的早期筛查。并可避免过度穿刺活检，减轻患者的疼痛。因而，pca3的检测对前列腺癌早期诊断与及时治疗有着重要的意义。

近年来，光学级联双环谐振腔传感器，由于具有体积小、结构简单、灵敏度高、集成度好、大批量生产的潜力等优点，已经受到科研工作者的广泛关注。《opticsexpress》2009,17(26):23817发表了daoxindai著作的《highlysensitivedigitalopticalsensorbasedoncascadedhigh-qring-resonators》，该文指出，具有游标效应的级联微环谐振器是一种高灵敏度的光学传感器。后来，一些研究者通过利用双环谐振腔的游标效应制备出了高灵敏度的级联双环谐振腔传感器，如《opticsexpress》2010,18(22):22747发表了tomclaes,wimbogaerts与peterbienstman合著的《experimentalcharacterizationofasiliconphotonicbiosensorconsistingoftwocascadedringresonatorsbasedonthevernier-effectandintroductionofacurvefittingmethodforanimproveddetectlimit》，该文给出的级联双环谐振腔传感器的灵敏度为2169nm/riu；《ieeephotonicstechnologyletters》2011,23(13):842发表了jinghu、daoxindai合著的《cascaded-ringopticalsensorwithenhancedsensitivitybyusingsuspendedsi-nanowires》，该文给出的级联双环谐振腔传感器的灵敏度为4.6×10⁵nm/riu；《sensors》2013.13(11):14601发表了vanessazamora,peterlützow等合著的《ahighlysensitiverefractometricsensorbasedoncascadedsinmicroringresonators》，该文所述的sin级联双环谐振腔传感器灵敏度达到6,317nm/riu；《opticsletters》2013,38(8):1349发表了xianxinjiang、jian-junhe等合著的《cascadedsilicon-on-insulatordouble-ringsensorsoperatinginhigh-sensitivitytransverse-magneticmode》，该小组制作出了24,300nm/riu的硅基级联双环谐振腔传感器；b.n.m.deoliveira，w.g.daniel，a.f.herbster在2019sbfotoninternationalopticsandphotonicsconference会议上发表的《multimodephotonicbiosensorbasedoncascadedringresonatorwithmach-zehnderinterferometerforvernier-effectrefractiveindexsensing》将级联双环谐振腔和mach-zehnder干涉仪结合，使级联双环谐振腔传感器的折射率灵敏度提高到40883.33nm/riu。到目前为止，级联双环谐振腔传感器是折射率灵敏度最高的传感器之一。因此，如果利用级联双环谐振腔传感器检测pca3，将有可能实现对pca3的高灵敏检测，将会对前列腺癌的早期诊断与及时治疗提供很大的帮助。

虽然级联双环谐振腔传感器具有很高的折射率灵敏度，但是由于级联双环谐振腔传感器会对相同折射率的物质会表现出同样的光谱信号，无法实现对pca3的选择性检测。如果采用直接将pca3基因探针与谐振腔表面的羟基官能团直接反应相连接的方法，通常会造成固定的pca3基因探针数量过少，以至于在检测pca3时会观察不到级联双环谐振腔传感器信号的变化，或观察到的信号变化非常微弱。因此，为了利用级联双环谐振腔传感器对pca3进行更精准的高灵敏度检测和诊断，有必要寻求性能优良的pca3探针功能化的级联双环谐振腔谐振腔芯片的制备方法。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测pca3的壳聚糖级联双环谐振腔芯片的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明的第一方面，提供一种检测pca3的壳聚糖级联双环谐振腔芯片，芯片包括：第一波导、第二波导和第三波导；所述第一波导和第二波导之间设有参考环，所述参考环分别与第一波导和第二波导相耦合；所述第二波导和第三波导之间设有传感环，所述传感环分别与第二波导和第三波导相耦合；入射光进入第一波导与参考环耦合，从参考环导出的光进一步与第二波导耦合，参考环与第二波导耦合后的光一部分从第二波导的mid端泄露，一部分进一步与传感环耦合，从传感环导出的光进一步与第三波导耦合后从pass端输出；

所述传感环的表面依次修饰固定硅烷偶联剂、壳聚糖薄膜和pca3基因探针。

优选的，所述硅烷偶联剂是3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷或3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷。

优选的，所述壳聚糖薄膜由壳聚糖或壳聚糖改性后的衍生物或掺杂其它纳米粒子的壳聚糖共聚物或共混物制成。

优选的，所述pca3基因探针是以pca3的4个外显子为模板进行设计的。

作为优选的方案，所述pca3基因探针的序列包括但不限于seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示，具体如下：

nh2-(ch2)6-aaaaattgttcaaagacccttcgtgtt；(seqidno.1)

nh2-(ch2)6-aaaaactgctgactttaccatctgaggccac；(seqidno.2)

nh2-(ch2)6-aaaaatcctggtctccctcggctgca；(seqidno.3)

本发明的第二方面，提供上述一种检测pca3的壳聚糖级联双环谐振腔芯片的制备方法，包括以下步骤；

(1)对硅基级联双环谐振腔进行清洁处理；

(2)对清洁处理后的传感环表面进行等离子处理；

(3)在传感环表面修饰硅烷偶联剂；

(4)在硅烷偶联剂修饰过的传感环表面进一步修饰壳聚糖；

(5)在传感环的壳聚糖表面进一步修饰pca3基因探针。

优选的，步骤(4)中，在传感环表面修饰壳聚糖是通过壳聚糖和传感环表面的硅烷偶联剂发生共价反应进行固定的。

优选的，步骤(5)中，所述的pca3基因探针是通过pca3基因探针与壳聚糖的共价反应固定于壳聚糖薄膜的表面。

本发明的第三方面，提供上述壳聚糖薄膜修饰的硅基级联双环谐振腔芯片在制备pca3诊断和/或检测产品中的用途。

本发明的第四方面，提供一种检测pca3的壳聚糖级联双环谐振腔芯片的制备方法，包括以下步骤：

将上述pca3基因探针功能化后的壳聚糖级联双环谐振腔芯片的传感环与待测液体接触，根据波长变化信号或者光功率强度变化信号对待测液体中的pca3进行定性或定量检测。

本发明的有益效果：

(1)本发明的一种检测pca3的壳聚糖级联双环谐振腔芯片的制备方法，所制备的芯片在用于检测pca3时，无需荧光标记，无需扩增，无需苛刻的实验条件及较长的周转时间，与磁性纳米微粒介导法、rt-pcr荧光定量法相比，大大简化了检测条件、检测步骤和检测时间。

(2)本发明的壳聚糖薄膜修饰的硅基级联双环谐振腔芯片，由于采用的壳聚糖材料无味、无臭、无毒、无害、不污染环境，操作过程更安全更环保。

(3)本发明的壳聚糖薄膜修饰的硅基级联双环谐振腔芯片，由于采用的壳聚糖材料具有良好的生物相容性、优良的抑菌杀菌性能，可以有效地延长检测芯片的使用寿命。

(4)本发明的壳聚糖薄膜修饰的硅基级联双环谐振腔芯片，由于采用的壳聚糖易溶于低酸度水溶液而不溶于水与碱，因而能更好地保护基底硅免受实验过程中液体的腐蚀。

(5)本发明的壳聚糖薄膜修饰的硅基级联双环谐振腔芯片，由于采用的壳聚糖分子中含有羟基、乙酰氨基和氨基功能基团，可供结构修饰的基团多，因而能更好地提高修饰固定pca3基因探针的数量，能有效地提高级联双环谐振腔传感器对pca3检测的信号强度，提高对pca3检测的灵敏度。

(6)本发明的一种检测pca3的壳聚糖级联双环谐振腔芯片的制备方法，采用壳聚糖提升固定pca3基因探针的数量，采用参考环和传感器提升器件的传感灵敏度，从器件和膜修饰两方面同时提高了对pca3的检测灵敏度，因而在高灵敏检测pca3方面更具优势。

综上，本发明的一种检测pca3的壳聚糖级联双环谐振腔芯片的制备方法，所制备的芯片在用于检测pca3时，可以无标记、高灵敏探测pca3，有望广泛应用于pca3的预防和治疗。

附图说明

图1：本发明的硅基级联双环谐振腔的剖面示意图；图中，1-入射光，2-第一波导，3-参考环，4-第二波导，5-第二波导的mid端，6-传感环，7-第三波导，8-第三波导的drop端。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，pca3的检测对前列腺癌早期诊断与及时治疗有着重要的意义。pca3定位于第9号染色体，全长约25kb，包含3个内含子和4个外显子，研究表明pca3是一种非编码rna基因，其蛋白产物非常少，因此对pca3的基因检测更具针对性。

基于光学环形谐振腔的生物传感器目前受到了人们的广泛关注。在环形谐振腔中，光波是绕着微环不断的循环传播，通过波导表面的倏逝波与被测样品接触发生作用。与传统平面光波导传感器不同的是，在环形谐振腔传感器中，因为光波不断的绕环传播，光波与被测样品的作用长度不再是谐振腔的物理实际长度，而是与谐振腔本身的品质因子q相关，因此，环形谐振腔可以以很小的物理尺寸实现很大的传感灵敏度，不仅实现了低成本、微型化，而且在生物传感过程中，还很大程度上节约了昂贵的药品。

级联双环谐振腔波导传感器是由两个半径不同的环形谐振腔组成，分别为传感环和参考环，其中，传感环没有旋涂上包层与待测液直接接触，而参考环则覆盖有一层上包层。当待测液浓度发生变化时，影响了波导中传输光的模式特性，进而影响了谐振波长变化或功率强度变化，通过分析谐振谱的变化可以得到待测液的参量变化。级联双环谐振腔传感器因其独特的双环结构，传感环和参考环形成类似于游标卡尺的游标放大效果，使器件灵敏度相对于传统单环传感器大大提升。

目前还未见有利用级联双环谐振腔波导传感器检测pca3的报道，基于此，本发明进行了深入研究，提出了一种可用于检测pca3的壳聚糖级联双环谐振腔芯片的制备方法。

在本发明的一种实施方案中，壳聚糖薄膜修饰的硅基级联双环谐振腔波导芯片包括：第一波导2、参考环3、第二波导4、传感环6和第三波导7，入射光1进入第一波导2与参考环3耦合，从参考环3导出的光进一步与第二波导4耦合，参考环3与第二波导4耦合后的光一部分从第二波导的mid端5泄露，一部分进一步与传感环6耦合，从传感环6导出的光进一步与第三波导7耦合后从pass端8输出(图1)，通过在硅基级联双环谐振腔芯片中的传感环6表面依次修饰固定硅烷偶联剂、壳聚糖薄膜、pca3基因探针，以修饰壳聚糖薄膜增加pca3基因探针的固定量，并利用pca3与pca3基因探针结合所引起的信号变化及传感环和参考环之间的游标放大效应来实现对pca3的高灵敏性选择性检测。

本发明所述的硅基级联双环是指参考环3和传感环6，修饰硅烷偶联剂、壳聚糖薄膜、pca3基因探针时所使用的微环谐振腔是传感环6，而不是参考环3。

本发明所述的对pca3的检测是通过感知传感环6的折射率变化来实现的。

本发明所述的在传感环表面修饰所使用的硅烷偶联剂为氨基硅烷或环氧基硅烷，具体可以选择3-氨基丙基三乙氧基硅烷或3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷或3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷。

本发明所述的壳聚糖薄膜在传感环6表面的固定是通过壳聚糖和传感环6表面的环氧基硅烷或氨基硅烷发生共价反应进行固定的。

本发明所述的制备壳聚糖薄膜时所采用的壳聚糖为壳聚糖或壳聚糖改性后的衍生物。所述制备的壳聚糖薄膜进一步还可以包括掺杂其它纳米粒子的壳聚糖共聚物或共混物。

本发明所述的pca3探针的固定是通过pca3探针与壳聚糖的共价反应固定于壳聚糖薄膜的表面。

本发明所述的pca3探针是采用pca3的4个外显子为模板进行设计的。

本发明所述的传感环6表面修饰pca3探针的过程包括以下步骤：

①对硅基级联双环谐振腔芯片进行清洁处理；

②对清洁处理后的传感环6表面进行等离子处理；

③在传感环6表面修饰环氧基硅烷或氨基硅烷；

④在氨基硅烷或环氧基硅烷修饰过的传感环6表面进一步修饰壳聚糖；

⑤在传感环6上的壳聚糖表面进一步修饰pca3探针。

本发明所述的芯片用于检测样品中pca3含量时所采用的信号为波长变化信号或者功率强度变化信号。

本发明所述的pca3探针具有与pca3特异性结合的性能，硅基级联双环谐振腔传感器是通过这种特异性结合所引起的信号变化来实现对pca3的选择性检测。

本发明所述的传感环6表面修饰pca3探针的过程可以具体为：将硅基级联双环谐振腔传感器的传感环进行等离子体处理，向等离子体处理后的传感环表面滴加含有硅烷偶联剂的溶液，处理30-60min；然后将传感环放入含有壳聚糖的溶液中，75-100℃反应4-36h，在硅烷偶联剂修饰的传感环表面进一步修饰壳聚糖薄膜；接着将传感环放入通入氮气的含丁二酸酐、dmap的溶液中，40-110℃反应5-48h；再将传感环转移到edc/nhs溶液中静置30-90min，随后转移到含有pca3基因探针的溶液中，在壳聚糖薄膜表面进一步修饰pca3基因探针。

其中，所述等离子体处理具体为：在10-12w的功率、50pa的真空度下进行plasma处理时间5min。

所述含有硅烷偶联剂的溶液包括但不限于：100％的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷或含有1％的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的无水甲苯溶液。

所述含有壳聚糖的溶液包括但不限于：含有壳聚糖的水溶液、含有壳聚糖的dmso溶液或含有壳聚糖的dmf溶液。需要说明的是：调节ph<5后，壳聚糖是可以溶于水的；当脱乙酰度为50％左右时，壳聚糖能溶解于水；壳聚糖的一些衍生物会溶于水。

所述含丁二酸酐、dmap的溶液中，丁二酸酐的浓度为1-100mg/ml，dmap的浓度为0.03-0.07g/l。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

实施例1

依次用丙酮、乙醇、去离子水对硅基级联双环谐振腔进行清洗15min，再在10.2w的功率、50pa(约为375mtor)的真空度下进行plasma处理时间5min，在等离子体处理过的硅基级联双环谐振腔的传感环6上滴加100％的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷处理1h，随后将传感环6放入5ml含有0.98g壳聚糖水溶液中，在80℃反应12h。接着将传感环6放入5ml含有0.5g丁二酸酐、0.15gdmap的四氢呋喃溶液中，在60℃反应5h。再将传感环6转移到新配制的0.04medc/0.01mnhs溶液中静置1h，随后转移到含有1μm的pca3探针nh2-(ch2)6-aaaaattgttcaaagacccttcgtgtt的pbs溶液中4℃冰箱反应过夜，制得可用于检测pca3的壳聚糖硅基级联双环谐振腔芯片。

实施例2

依次用丙酮、乙醇、去离子水对硅基级联双环谐振腔进行清洗15min，再在10.2w的功率、50pa(约为375mtor)的真空度下进行plasma处理时间5min，在等离子体处理过的硅基级联双环谐振腔的传感环6表面滴加含有1％的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的无水甲苯溶液处理30min，随后经过110℃干燥1h后，将传感环6放入5ml含有1g壳聚糖dmso中，在75℃反应36h。接着将传感环6放入10ml通入氮气的含有12.34mg丁二酸酐的dmso溶液中，在40℃反应24h。再将传感环6转移到新配制的0.02medc/0.01mnhs溶液中静置1h，随后转移到1μm的pca3探针nh2-(ch2)6-aaaaactgctgactttaccatctgaggccac的pbs溶液中4℃冰箱反应过夜，制得可用于检测pca3的壳聚糖硅基级联双环谐振腔芯片。

实施例3

依次用丙酮、乙醇、去离子水对硅基级联双环谐振腔进行清洗15min，再在10.2w的功率、50pa(约为375mtor)的真空度下进行plasma处理时间5min，在等离子体处理过的硅基级联双环谐振腔的传感环6上滴加100％的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷处理30min，随后将传感环6放入6ml含有200mg壳聚糖的dmf溶液中，在100℃反应4h。接着将传感环6放入5ml通入氮气的含有16.3mg丁二酸酐、0.322gdmap的无水甲苯溶液中，在110℃反应48h。再将传感环6转移到新配制的0.2medc/0.05mnhs溶液中静置1h，随后转移到1μm的pca3探针nh2-(ch2)6-aaaaatcctggtctccctcggctgca的pbs溶液中4℃冰箱反应过夜，制得可用于检测pca3的壳聚糖硅基级联双环谐振腔芯片。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

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<110>济南国科医工科技发展有限公司

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