超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱测定化妆品中6种硝基苯类化合物的方法与流程

本发明涉及一种超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱测定化妆品中6种硝基苯类化合物的方法，属于分析检测。

背景技术：

1、硝基苯类化合物是染发剂(对苯二胺、对氨基苯酚、甲苯-2,5-二胺硫酸盐等)生产中的重要原料或中间体，如果化妆品生产企业对其使用的原料质量审核不严格，硝基苯类物质易作为残留杂质而带入染发类化妆品中。消费者在长期反复使用染发类产品过程中，硝基苯类物质累积于毛发、头皮等组织部位，通过透皮吸收，作用于人体血液、肝脏及中枢神经系统，从而产生过敏性皮炎、致畸及致癌等危害。因此，欧盟及我国的化妆品法规都明确规定，3,4-二硝基甲苯、2,3-二硝基甲苯、2,4-二硝基甲苯、2,6-二硝基甲苯、2,5二硝基甲苯、3,5-二硝基甲苯等6种硝基苯类化合物列入化妆品禁用原料。

2、关于硝基苯类化合物的检测方法主要有气相色谱-氢火焰离子化检测器法、气相色谱-电子捕获检测器法、气相色谱-质谱联用法和高效液相色谱法，测试的产品或对象包括水、空气、土壤、皮革制品、纺织品、化妆品等。鉴于硝基苯类物质易气化，毛细管柱分离简单快捷，因此化妆品中硝基苯类化合物的标准方法均指向气相色谱-质谱法。然而，gc-ms法存在前处理简单、检测灵敏度不高等局限性，例如样品经弱极性溶剂提取后，提取液中尚含有大量的蜡质成分，直接进样容易造成色谱柱和质谱检测器污染，降低检测效率，缩短色谱柱和仪器使用寿命；或者提取液稀释倍数过大，检测限较低，造成假阳性结果。

3、故亟需一种可以解决gc-ms法的前处理缺陷，提高检测灵敏度，为化妆品质量安全监测提供新的技术选择的超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱测定化妆品中6种硝基苯类化合物的方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，本发明提供一种超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱测定化妆品中6种硝基苯类化合物的方法，该法方法灵敏，回收率高，重复性好，可用于多种基质类型化妆品中硝基苯类化合物的检测，为确保化妆品使用安全，打击化妆品行业非法添加禁用原料的行为提供了新的思路和技术支持。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

3、超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱测定化妆品中6种硝基苯类化合物的方法，包括以下步骤：

4、s01，标准溶液的配制；

5、s02，样品处理：

6、称取样品0.50g，置于25ml比色管中，加入10ml乙酸乙酯，涡旋混匀后，超声提取15min，5000r/min下离心5min，上清液经无水硫酸钠脱水后置于50ml圆底烧瓶中，10ml乙酸乙酯重复提取1次，合并提取液，加入钯碳5％ pd 50mg，置于常压加氢装置中，在通风柜开放的情况下，通入氢气，氢气流速为2m/s，40℃反应2h，反应液经5000r/min下离心5min，收集上清液于25ml氮吹管中，置于40℃水浴中氮气吹干，加入1.0ml甲醇涡旋复溶，经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液待测；

7、s03，色谱条件：

8、色谱柱：agilent poroshell 120ec-c18 column(100mm×4.6mm，2.7μm)；流动相：a为0.1％甲酸水溶液，b为乙腈；流速：0.5ml/min；进样量：5μl；柱温：20℃；梯度洗脱程序：0～10min，98％a，2％b；10～10.5min，98％a～5％a，2％b～95％b；10.2～14min，5％a，95％b；14～14.2min，5％a～98％a，95％b～2％b；14.2～17min，98％a，2％b；

9、s04，质谱条件：

10、离子源：电喷雾离子源；正离子模式；全扫描范围：m/z 50～1000；质谱数据采集模式：信息依赖性扫描源内裂解auto ms/ms cid；实时校正液：10mmol/l甲酸钠溶液；干燥气温度：200℃；干燥气流速：8.0l/min；雾化气压力：2.0bar；毛细管电压：4500v；

11、s05，化合物标准谱库的建立；

12、6种硝基苯类化合物为3,4-二硝基甲苯、2,4-二硝基甲苯、2,6-二硝基甲苯、2,3-二硝基甲苯、2,5二硝基甲苯和3,5-二硝基甲苯。

13、s01中，标准溶液的配制方法如下：

14、标准储备液：分别准确称取3,4-二硝基甲苯、2,4-二硝基甲苯、2,6-二硝基甲苯、2,3-二硝基甲苯、2,5二硝基甲苯和3,5-二硝基甲苯标准品约25.00mg，置于10ml容量瓶中，加入乙酸乙酯溶解并定容至刻度，置于4℃冰箱备用；

15、混合标准储备液：精密移取标准储备液0.10ml，置于25ml容量瓶中，加入乙酸乙酯溶解并定容至刻度，置于4℃冰箱备用；

16、混合标准反应液：精密移取标准储备液各0.50ml，置于50ml圆底烧瓶中，加入20ml乙酸乙酯，超声使溶解，加入钯碳5％ pd 50mg，置于常压加氢装置中，通入氢气，氢气流速为2m/s，40℃反应2h，反应液于5000r/min下离心5min，收集上清液于25ml氮吹管中，置于40℃水浴中氮气吹干，加入2ml甲醇涡旋复溶后转移至10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，置于4℃冰箱备用；

17、空白基质混合标准工作液：精密移取上述6种化合物的混合标准反应液适量，用空白基质提取液配制成系列浓度的混合标准工作液，待测。

18、分别精密移取混合标准反应液0.016ml、0.04ml、0.08ml、0.20ml、0.40ml、0.80ml、2.00ml、4.00ml于8个不同的10ml容量瓶中，用空白基质提取液定容至刻度，即得系列浓度的混合标准工作液，浓度分别为：0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、25.0μg/ml、50.0μg/ml；

19、空白基质按s02处理后，提取液氮吹至干后，用10ml甲醇溶解，即得空白基质提取液。

20、s02中，样品若为膏霜、唇膏、粉剂类化妆品，需先加入2ml二氯甲烷，涡旋使样品分散均匀后，再加入10ml乙酸乙酯涡旋。

21、s05中，化合物标准谱库的建立方法为：采用上述色谱条件和质谱条件，在信息依赖性扫描模式下对质量浓度为5mg/l的6种硝基苯类化合物待测物的混合标准反应液进样分析，从而获得化合物的保留时间、一级母离子精确质量数、同位素峰形和二级子离子精确质量数，建立包含上述信息的化合物标准谱库；

22、样品经处理后上机测定，将采集的数据导入target analysis软件中，比对样品质谱信息与化合物标准谱库；在相同实验条件下，如果被测样品在提取相应分子离子的质量色谱图中出现了与标准品保留时间一致的色谱峰、一级和二级离子精确质量数偏差不高于5mda、同位素峰形匹配度≥85％且评分标准不低于“++”时，则判断被测样品中存在相应的硝基苯类化合物。

23、化妆品包括膏霜、化妆水、爽身粉、唇膏。

24、6种硝基苯类化合物的检出浓度在0.03mg/kg～0.2mg/kg之间，定量下限在0.1mg/kg～1.0mg/kg之间。

25、2,6-二硝基甲苯的保留时间为2.2min，2,5二硝基甲苯的保留时间为2.7min，3,5-二硝基甲苯的保留时间为3.6min，2,4-二硝基甲苯的保留时间为3.8min，3,4-二硝基甲苯的保留时间为8.0min，2,3-二硝基甲苯的保留时间为8.3min。

26、本发明的方法在化妆品中硝基苯类化合物定性定量分析检测中的应用。

27、本发明具有如下有益效果：

28、本发明选择非质子化溶剂-乙酸乙酯提取样品，提取液经催化氢化转化成易于离子化的苯胺类化合物，反应液经氮吹浓缩甲醇复溶，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱测定，以保留时间、一级母离子精确质量数、同位素丰度比、二级子离子精确质量数构建筛查数据库并对检测结果检索，实现化妆品中6种硝基苯类化合物的筛查确证，同时建立了基质匹配标准曲线外标定量方法。本方法的建立，一是填补了lc-ms法测定硝基苯类物质的空白，二是解决了gc-ms法的前处理缺陷，三是提高了检测灵敏度，为化妆品质量安全监测提供了新的技术选择。