含2,4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其制备方法与应用
【专利说明】含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其制备方法与应用 【技术领域】
[0001] 本发明涉及巯基蛋白质的检测领域，具体地说，是一种含2,4_二硝基苯磺酰基香 豆素类化合物及其制备方法与应用。 【【背景技术】】
[0002] 细胞内蛋白质上的巯基由于其易被活性氧化物或活性氮分子氧化，可以在氧化态 的疏基(-SH)和还原态的二硫键(S-S)间相互转化，在调节细胞内蛋白质的氧化还原平衡， 信号传导等方面具有很重要的生理学意义。此外，含巯基蛋白质的表达与多种疾病有关，例 如癌症，糖尿病，神经退性形变。因此，选择性检测细胞内的巯基蛋白具有重要的意义。
[0003] 荧光法由于其灵敏度高、选择性好、操作过程简单，且可用于活体成像等优点在很 多领域广受关注。香豆素荧光团具有荧光量子产率高，稳定性好等特性，是一种常用的荧光 团。此类荧光团的荧光量子产率随溶剂极性的变化而变化，通常在水溶液中荧光量子产率 较低，而在非极性溶剂中荧光量子产率较高，因此常用于制备极性敏感的荧光探针。2,4_二 硝基苯磺酰基是一种比较常见的荧光猝灭基团，但其易被含巯基的化合物取代，常常用作 荧光探针的受体单元用于检测小分子硫醇。本发明将2,4_二硝基苯磺酰基通过共价键连接 到极性敏感的香豆素荧光团上，只有当荧光分子中的受体被硫醇取代且化合物同时处于非 极性环境中，体系的荧光才会有明显的增强，利用此特性可以将巯基蛋白与小分子硫醇以 及其它不含自由巯基的蛋白质区分开，从而实现对巯基蛋白的特异性响应。 【
【发明内容】
】
[0004] 本发明的目的在于检测含疏水空腔的疏基蛋白质，排除不含自由疏基蛋白质以及 小分子硫醇的干扰，提供一种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其在巯基蛋白质检 测中的应用。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0006] -种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物，其结构通式：
[0007]
[0008] 式中：κ为氧，m取代的烷基，生物素 ，吗卩林，匍甸糖或者·采糖；2，4-二硝基苯磺酰 基在幾基的邻、间和对位。
[0009] -种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物的合成方法，其具体步骤为：
[0010] (1)将溶剂，3-甲氧基苯胺，碳酸钾，碘化钠，四丁基溴化铵TBAB以及溴乙烷加入到 反应器中，将混合物加热回流4~10小时后，真空旋蒸去除溶剂;反应产物过硅胶柱，得无色 油状物1;
[0011]所述的溶剂为乙腈或N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃或二甲基亚砜；
[0012] 3-甲氧基苯胺和碳酸钾的摩尔比为1:1~1: 3,优选为1:1.5; 3-甲氧基苯胺和碘化 钠的摩尔比为1:0.05~1:0.15,优选为1:0.1 ;3_甲氧基苯胺和四丁基溴化铵TBAB的摩尔比 为1:0.05~1:0.2,优选为1:0.1 ;3_甲氧基苯胺和溴乙烧的摩尔比为1:0.8~1:1.5,优选为 1:1; 3-甲氧基苯胺以及溴乙烷二者混合物与溶剂的固液比为7~9:45~55，优选为3:80; [0013] (2)将步骤(1)得到的无色油状物1和Cs 2C03置于有机溶剂中搅拌加热回流;当溶液 回流5~30min后再逐滴加入1，2-二溴乙烷，继续反应5~36小时；反应液冷却后抽虑，收集 滤液旋干，过硅胶柱，得无色油状物2;
[0014] 无色油状物和CS2CO3的摩尔比为1:1~1:3,优选为1:1.5;无色油状物1和1，2_二溴 乙烧的摩尔比为1:5~1:20,优选为1:10;
[0015] (3)将步骤(2)得到的无色油状物2加入无水有机溶剂中，氮气保护，-10°C~-78°C 下逐步滴加三溴化硼的无水二氯甲烷溶液，反应10~60min后缓慢升温至室温继续反应3~ 24h;冰浴下加水猝灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机相依次用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清 洗，清洗后旋干过硅胶柱，得无色油状物3;
[0016] 无色油状物2和三溴化硼的摩尔比为1:1~1:10,优选为1:2.5;无色油状物2和二 氯甲烷的摩尔体积比为1:5~1:20，优选为1:10;
[0017] (4)在氮气保护，冰浴下逐滴滴加三氯氧磷于有机溶剂中，保持冰浴反应15~ 45min，再向上述溶液滴加含步骤(3)得到的无色油状物3的有机溶剂溶液，冰浴下反应10~ 45min后移至室温反应5~45min，而后加热至50~90°C反应2~8h，加水猝灭反应，乙酸乙酯 萃取，保留有机相;有机相依次用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水清洗，清洗后旋干过硅胶柱， 得白色固体4;
[0018] 三氯氧磷和溶剂的摩尔体积比为15:1~1:1，优选为8.25:1;无色油状物2和溶剂 的摩尔体积比为10:1~1:1，优选为4.1:1;
[0019] 所述的溶剂为乙腈或N，N_二甲基甲酰胺或四氢呋喃或二甲基亚砜。
[0020] (5)步骤(4)得到的白色固体4和丙二酸二乙酯溶于无水有机溶剂-哌啶中，回流反 应4~12h后旋干溶剂;再加入浓盐酸和冰醋酸于反应物中，其中，加热回流反应4~12h，反 应液自然冷却至室温;冰浴下，加入氢氧化钠溶液调节反应液的pH至4~6，抽虑，得淡黄色 固体5;
[0021] 白色固体4和丙二酸二乙酯的摩尔比为1:0.5~1:3,优选为1:1.2;白色固体4和溶 剂的摩尔体积比为1:1~1:100,优选为1:12.5;哌啶和溶剂的体积比为1:10~1:300,优选 为 1:100;
[0022]白色固体4和混酸的摩尔体积比为1:1~1: 50,优选为1: 5;浓盐酸和冰醋酸的体积 比为1:0.1~1:10,优选为1:1;
[0023] 所述的溶剂为乙腈或乙醇或N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃或二甲基亚砜；
[0024] (6)在氮气保护，冰浴下逐滴滴加三氯氧磷于有机溶剂中，保持冰浴反应15~ 45min，再向上述溶液滴加含步骤(5)得到的淡黄色固体5的有机溶剂溶液，冰浴下反应10~ 45min后移至室温反应5~45min，而后加热至50~90°C反应2~8h，加水猝灭反应，乙酸乙酯 萃取，保留有机相;有机相依次用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗，清洗后旋干过硅胶柱，得 棕黄色固体6;
[0025] 三氯氧磷和有机溶剂的体积比为1:0.5~1:10，优选为1:3;
[0026] 淡黄色固体5和有机溶剂的摩尔体积比为1:0.1~1:10,优选为1:1;
[0027] (7)将步骤(6)得到的棕黄色固体6,叠氮化钠和碘化钠溶于有机溶剂中，氮气保护 下于60~90 °C反应6~12h后，向反应液中加入冰水，抽虑得棕黄色固体7;
[0028]棕黄色固体6和有机溶剂的摩尔体积比为1:0.1~1:10,优选为1:1;棕黄色固体6 和叠氮化钠的摩尔比为1:0.5~1:10,优选为1:5;棕黄色固体6和碘化钠的摩尔比为1:0.05 ~1:10,优选为1:0.1;
[0029] 棕黄色固体6和冰水的摩尔体积比为1:10~1:100,优选为1:23;
[0030] (8)将步骤(7)得到的棕黄色固体7溶于无水的混合有机溶剂中，搅拌下分别加入 4-羟基苯乙酮和吡咯烷，室温反应24~48h，旋干反应液;再加入1~10L的石油醚，抽虑，得 红色固体8;
[0031] 棕黄色固体7和有机溶剂的摩尔体积比为1:1~1:100,优选为1:20;棕黄色固体7 和4-羟基苯乙酮的摩尔比为1:0.5~1:10,优选为1:1.8;吡咯烷用量为0.5~lOOrnL;
[0032] (9)将步骤(8)得到的红色固体8加入到有机溶剂中，氮气保护下滴加三苯基磷的 有机溶剂溶液，55~75 °C反应4~8h后加入水，继续反应8~15h，旋干反应液，过硅胶柱，得 红色固体9;
[0033] 其中，红色固体8和有机溶剂的摩尔体积比为1:1~1:100,优选为1:40;红色固体8 和三苯基磷的摩尔比为1:0.5~1:10,优选为1:1.5;
[0034] (10)将D-生物素，1-羟基苯并三唑Η0ΒΤ和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐EDC.HC1溶于有机溶剂中，向上述体系滴加三乙胺，室温下反应10~45min后加入步 骤(9)得到的红色固体9，继续反应2~6h;加入1~10L饱和食盐水，抽虑，将所得红色固体溶 于1~10L二氯甲烷中，分别用饱和碳酸氢铵，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗，清洗后旋干 有机相过硅胶柱，得红色固体10;
[0035] D-生物素和有机溶剂的摩尔体积比为1:1~1: 50,优选为1: 20;D-生物素和Η0ΒΤ的 摩尔比为1:0.5~1:10,优选为1:1.2;D-生物素和EDC.HC1的摩尔比为1:0.5~1:10,优选为 1:1.2 ;D-生物素和三乙胺的摩尔比为1:0.5~1:10,优选为1:1.8;
[0036] D-生物素和红色固体9的摩尔比为1:0.5~1:10,优选为1:1;
[0037] (11)将步骤（10)得到的红色固体10,乙胺溶于有机溶剂中，氮气保护，冰浴下缓 慢滴加2,4_二硝基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，继续反应2~5h，旋干有机相过硅胶柱，得目 标产物；
[0038] 红色固体10和2,4_二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1:0.8~1:2,优选1:1.2;红色固体 10和乙胺的摩尔比为1:0.8~1:2,优选1:1.2;红色固体10和有机溶剂的摩尔体积比为1:1 ~1:100,优选为1:40; 2，4_二硝基苯磺酰氯和二氯甲烷的摩尔体积比为1:1~1:100,优选 为 1:10;
[0039] -种含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素类化合物在巯基蛋白质检测中的应用，其具体 步骤为：
[0040] (1)制备含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素化合物的二甲亚砜DMS0溶液，为储备液1;
[0041 ] (2)制备半胱氨酸和卵清白蛋白0VA的水溶液分别为储备液2和储备液3;
[0042] (3)准确移取10L储备液1至10mL的容量瓶内，用不同比例的乙腈与20mM的磷酸盐 缓冲液(pH=7.4)稀释至刻度待用；移取3mL上述溶液至比色皿中，加入10~30mL的储备液 3