，使OVA浓度为lmg/mL，测定探针在不同比例的乙腈与水混合溶液中紫外和荧光光谱随时 间变化情况，即巯基蛋白对含2,4_二硝基苯磺酰基香豆素化合物的时间曲线;将储备液3换 成储备液2，重复上述操作，即得小分子硫醇对含2，4-二硝基苯磺酰基香豆素化合物的时间 曲线。
[0043] 与现有技术相比，本发明的积极效果是：
[0044] 新型探针分子具有较大的斯托克斯位移和较长的发射波长(584nm)，有利于减少 生物体背景的干扰。在生理pH条件下(pH= 7.4)，该探针对含巯基的蛋白质(OVA，BSA)具有 较好的响应，且半胱氨酸、高半胱氨酸以及谷胱酐肽等小分子硫醇对巯基蛋白的检测基本 无影响。
[0045]图la 0VA对探针SPS1发射光谱(a)的影响； 【【附图说明】】
[0046] 图lb 0VA对探针SPS1吸收光谱(b)的影响；
[0047] ]\^^:卩85=1:4(￥:￥，？!1=7.4,2〇1111)混合溶液，[5?51] = 1(^]\1，[0￥厶]=111^/1111^荧 光激发波长为465nm。
[0048] 图2不同种类蛋白质对探针SPS1发射光谱的影响(OVA含四个自由巯基，BSA含一个 自由巯基，Casin和Pepesin都不含自由巯基;0VA，BSA和Casin都含有疏水空腔）；MeCN:PBS =1:4(￥1印!1=7.4,2〇1111)混合溶液，[5?52] = 1〇11]\1，[0￥厶]=[85厶]=[。&8111] = [?6口68111] = lmg/mL;焚光激发波长为465nm〇
[0049] 图3相同条件下OVA和Cys对探针SPS1发射光谱的影响；[SPS1 ] = 10uM，[OVA]= lmg/mL，[ Cys ] = 0 · 5mM;焚光激发波长为465nm〇
[0050] 图4 SPS1的分子结构式。
[00511图5化合物SPS1的合成图式；
[0052]图6现有的Probel，Probe2和Probe3结构式。
[0053]以下提供一种含2,4_二硝基苯磺酰基香豆素类化合物及其制备方法与应用的具 体实施方式： 【【具体实施方式】】
[0054] 实施例1
[0055]化合物SPS1的合成：
[0056] 化合物1的合成:称取1.67g 3-甲氧基苯胺（13.6mmol)，2.82g碳酸钾(20.4mmol)， 203 · 9mg碘化钠 （1 · 36mmol)和438mg TBAB(1 · 36mmol)加入到250mL的圆底烧瓶中，加入80mL 的乙腈搅拌加热回流。回流后缓慢滴加 1.48g (13.6mmo 1)的溴乙烷，继续反应8h。点板（乙酸 乙酯:石油醚= 4:50)，原料反应完全。反应液冷却后抽虑，收集滤液旋干，过硅胶柱(石油醚 :乙酸乙酯=50:2)，得无色油状物1.148。1!1匪1?(40010^，0)(：13)6 :7.08(^ = 8.1!^，1!〇， 6.26(dd，Ji = 1.9Hz，J2 = 8.1Hz，lH)，6.22(dd，Ji = 1.5Hz，J2 = 8.10Hz，lH)，6.16(s，lH)， 3.77(s,3H),3.14(q J = 7.2Hz,2H),1.25(t ,J = 7.2Hz,3H)〇
[0057]化合物2的合成：称取1. OOg(6.6 lmmo 1)) (N-乙基）间甲氧基苯胺（化合物1)和 3.23g(9.92mmol)的Cs2C03于250mL的三口烧瓶中，加入80mL的乙腈搅拌加热回流。当溶液回 流 10min后再逐滴加入12.48(66.1111111〇1)1，2-二溴乙烷，继续反应1811。点板（乙酸乙酯：石油 醚= 4:50)，原料反应完全。反应液冷却后抽虑，收集滤液旋干，过硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯 =50:1)，得无色油状物1.438。1!1匪1?(4001抱，〇0(：13)3:7.08(^ = 8.1抱，1!〇,6.26((1(1，了1 = 1.9Hz，j2 = 8.1Hz，lH)，6.22(dd，Ji=1.5Hz，j2 = 8.1Hz，lH)，6.16(s，lH)，3.77(s，3H)， 3.66(t，J = 8.3Hz，2H)，3.46(t，J = 8.3Hz，2H)，3.40(q，J = 7.0Hz，2H)，1.18(t，J = 7.0H z， 3H)〇
[0058] 化合物3的合成:秤取1.(^(4.3〇臟〇1)0-乙基4-(2-)溴乙基）间甲氧基苯胺(化 合物2)于100mL的三口烧瓶中，加入40mL无水二氯甲烷，氮气保护，-78°C下逐步滴加 lmL (10.6mmol)三溴化硼(三溴化硼溶于10mL无水二氯甲烷中），反应30min后缓慢升温至室温 继续反应3h。点板(石油醚：乙酸乙酯= 50:8)，原料反应完全，冰浴下加水猝灭反应，乙酸 乙酯萃取，保留有机相。有机相依次用饱和碳酸氢钠（100mLX2)、饱和食盐水（100mLX3)清 洗，清洗后旋干过硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯=50:4 )，得无色油状物61 Omg (产率:61.6 % )。 咕 NMR(400MHz，DMS0-d6)S:9.17(s，lH)，6·96(ι?，1Η)，6· 15-6.05(m，3H)，3.71 (t，J = 7.3Hz， 2H)，3.46(t，J = 8.3Hz，2H)，3.59-3.53(m，4H)，1.07(t，J = 7.0Hz，3H)。
[0059] 化合物4的合成:量取3mL的DMF于lOOmL的三口烧瓶中，氮气保护，冰浴下逐滴滴加 1 · 5mL三氯氧磷（16 · 51mmol)，保持冰浴反应30min，滴加 1 · 90g(8 · 26mmol )3-(N-乙基-N-(2-)氯乙基)氨基苯酚(化合物3,溶于3mL DMF)，冰浴下反应30min后移至室温反应30min， 而后加热至60°C反应3h，溶液逐渐变为棕黄色。点板(石油醚：乙酸乙酯= 50:8)，原料反应 完全，加100mL水猝灭反应，乙酸乙酯萃取，保留有机相。有机相依次用饱和碳酸氢钠（100mL X 2 )、饱和食盐水（100mL X 3)清洗，清洗后旋干过硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯=50:4 )，得白 色固体USgc/H NMR(400MHz，CDCl3)S:11.58(s，lH)，9.54(s，lH)，7.32(d，J = 8.9Hz，lH)， 6 · 29(dd，Ji = 2 ·0Ηζ，J2 = 8 ·9Ηζ，1H)，3· 71-3.67(m，2H)，3.51-3.62(m，2H)，3.49(q，J = 7.1Hz，2H)，1.23(t，J = 7.1Hz，3H)。
[0060] 化合物5的合成:秤取1.7(^(7.96111111〇1)4-0-乙基-~-(2-)氯乙基)氨基水杨醛(化 合物4)和1.53g(9.55mmol)丙二酸二乙酯于250mL的单口烧瓶中，加入100mL的无水乙醇和 lmL哌啶，加热至90 °C回流，溶液变为棕黄色，反应8h后点板(石油醚：乙酸乙酯=50:25 )，原 料反应完全，旋干乙醇。向旋干的反应液中加入20mL的浓盐酸和20mL的冰醋酸，加热至106 °C回流。反应8h后点板(石油醚：乙酸乙酯= 50: 25)，原料反应完全，反应液自然冷却至室 温。冰浴下，向反应液中加入1M的氢氧化钠溶液，调pH至5~6，溶液中有大量的淡黄色固体 析出，静置30min后抽虑，将滤饼烘干，得1.23g淡黄色固体。4 NMR(400MHz，⑶α3)δ:1〇.15 (s，lH)，8.29(s，lH)，7.47(d，J = 8.9Hz，lH)，6.68(dd，Ji = 1.8Hz，j2 = 8.9Hz，lH)，6.54(s， 1Η)，6· 10(d，J = 9.4Hz，lH)，3.77(t，J = 6.7Hz，2H)，3.68(d，J = 6.6Hz，2H)，3.57(q，J = 7.1Hz，2H)，1.28(t，J = 7.1Hz，3H)。
[00611化合物6的合成:量取3mL的DMF于lOOmL的三口烧瓶中，氮气保护，冰浴下逐滴滴加 1.5mL三氯氧磷（16.51mmol)，保持冰浴反应30min，滴加 1.23g(4.89mmol )7-(N-乙基-N-(2-)氯乙基)氨基香豆素 (化合物5,溶于5mLDMF)，冰浴下反应30min后移至室温反应30min， 而后加热至60 °C反应3h，溶液逐渐变为红棕色。点板(石油醚：乙酸乙酯=50:25 )，原料反应 完全，加 100mL水猝灭反应，乙酸乙酯萃取，保留有机相。有机相依次用饱和碳酸氢钠（100mL X 2 )、饱和食盐水（100mL X 3)清洗，清洗后旋干过硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯=50:4 )，得棕 黄色色固体SOOrng。1!! NMR(400MHz，CDCl3)S:10.15(s，lH)，8.29(s，lH)，7.47(d，J = 8.9Hz， lH)，6.68(dd，Ji = 1.8Hz，j2 = 8.9Hz，lH)，6.54(s，lH)，6.10(d，J = 9.4Hz，lH)，3.77(t，J = 6.7Hz，2H)，3.68(d，J = 6.6Hz，2H)，3.57(q，J = 7.1Hz，2H)，1.28(t，J = 7.1Hz，3H)。
[0062] 化合物7的合成:秤取1.2(^(4.29臟〇1)7-0-乙基4-(2-)氯乙基)氨基香豆素(化 合物6)，1.39g(21.45mmol)叠氮化钠和64.3mg(0.43mmol)的碘化钠，量取10mL的DMF于 100mL的三口烧瓶中，氮气保护，60°C反应6h后，点板(石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷:三乙胺 = 10: 3:50:1)原料反应完全。向反应液中加入150mL冰水，有大量棕黄色固体析出，静置 30min后抽虑，烘干滤饼，得棕黄色固体0 · 95g。咕 NMR(400MHz，CDC13)δ: 10 · 15 (s，1H)，8 · 29 (s，lH)，7.47(d，J = 8.9Hz，lH)，6.68(dd，Ji = 1.8Hz，j2 = 8.9Hz，lH)，6.54(s，lH)，6.10(d，J = 9.4HzaH),3.61-3.54(m,6H)a.28(t J = 7.1Hz,3H)〇
[0063] 化合物8