专利名称：十八种复合氨基酸注射液的高效液相色谱法测定方法
技术领域：
本发明涉及一种药品检验专业的十八种复合氨基酸注射液的高效液相色谱法测定方法。
现有技术中的复合氨基酸注射液的定量测定主要采用氨基酸自动分析仪，或者采用成套高效液相色谱法柱后、柱前衍生装置。这类仪器和装置的缺点是设备价格昂贵，不能同时分离十八种复合氨基酸，分析时间长。
本发明的目的是要提供一种采用高效液相色谱仪，以2.4-二硝基氟苯作柱前衍生试剂的十八种复合氨基酸注射液的高效液相色谱法测定方法。它能有效地在30分钟内一次分离出十八种复合氨基酸，进行各组分氨基酸含量的定量分析和测定。
本发明采用的检测仪器是具有梯度洗脱功能的普通高效液相色谱仪。它包括有梯度泵，进样阀和碳-18反相分析柱等仪器;紫外-可见分光光度检测器;电脑积分仪。
本发明采用的检测条件是紫外一可见分光光度检测器在360nm波长处检测，分析柱的柱温为30℃，梯度洗脱剂采用流动相A和流动相B。流动相A为1∶1的乙腈溶液;流动相B为醋酸钠和醋酸缓冲液，其浓度为0.05mol/L，PH值为6.4，并且含有1%的N，N-二甲基甲酰胺离子对。采用固定的流动相程序，即流动相A和流动相B在0-30分钟内的浓度比在16∶84至98∶2之间逐渐变化，流速为1ml/min。衍生化温度采用60℃±2℃水浴，时间60分钟。衍生化缓冲液为PH值为7.0的磷酸二氢钾。检测进样量为10uL。电脑积分仪的记录纸走纸速度为0.5cm/mln。
本发明的检测原理是对大多数本身不产生荧光和无紫外吸收的氨基酸，采用2.4-二硝基氟苯作衍生试剂直接衍生化，获得能够被检测的衍生物。在碱性条件下，氨基酸的氨基能定量地与衍生试剂2.4-二硝基氟苯反应生成黄色衍生物二硝基苯氨基酸。采用离子对色谱法，利用取代基，脂肪烃，芳香烃，杂环，羟基，巯基和等电点的差异，对生成的衍生物二硝基苯氨基酸在碳-18反相分析柱上分离，将N，N-二甲基甲酰胺加入流动相中，使带负电的羧基与N，N-二甲基甲酰胺的正离子形成离子对，从而使被分离氨基酸峰面增大，保留时间延长。柱效提高，所形成的非极性基团与反相柱填料相互作用，使各种氨基酸得到分离。色谱分离后的各种氨基酸经过紫外一可见分光光度检测器和电脑积分仪的检测和处理，作出色谱图，然后根据色谱图完成各组分氨基酸百分含量分析和测定。
本发明采用的标准对照品是L-天门冬氨酸，L-谷氨酸，L-丝氨酸，L-甘氨酸，L-苏氨酸，L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-缬氨酸，L-蛋氨酸，L-胱氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-色氨酸，L-苯基丙氨酸，L-组氨酸，L-半胱氨酸，L-赖氨酸，L-酪氨酸。其氨基酸含量均在99%以上。
本发明采用下列分析纯质量的检测试剂乙腈，醋酸钠，醋酸，碳酸氢钠和磷酸二氢钾，2.4-二硝基氟苯为衍生试剂，经减压蒸馏纯化。
本发明的目的是这样实现的采用上述检测仪器，检测条件，检测原理，标准对照品和检测试剂来完成十八种复合氨基酸注射液的高效液相色谱法测定过程。精确取供试品和对照品分别加水制成一定浓度的溶液，各精确量取1-2ml置于10ml容量瓶中，加0.5mol/l浓度，PH9的碳酸氢钠溶液1ml，加2.4-二硝基氟苯10ul，乙腈1ml，振摇均匀，置60℃水浴中暗处加热60分钟后取出，加PH7.0的磷酸二氢钾缓冲液至刻度，振摇均匀。取10ul定量稀释后的衍生产物二硝基苯氨基酸，经进样阀直接注入高效液相色谱仪的碳-18反相分析柱。同时，将梯度洗脱剂流动相A和流动相B按检测条件所述的流动相程序，以1ml/min的流速由梯度泵送入进样阀。经高效液相色谱仪的碳-18反相分析柱进行色谱分离。在这一过程中各氨基酸衍生物与反相柱填料相互作用，使各种氨基酸得到分离。经碳-18反相柱完成色谱分离，色谱分离后的各种氨基酸经紫外-可见分光光度检测器作定量检测，检测电信号送入电脑积分仪进行数据处理，并且在记录纸带上依次画出各种氨基酸色谱图。该色谱图分离出的各种氨基酸顺序是L-天门冬氨酸，L-谷氨酸，L-丝氨酸，L-甘氨酸，L-苏氨酸，L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-缬氨酸，L-蛋氨酸，L-胱氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-色氨酸，L-苯基丙氨酸，L-组氨酸，L-半胱氨酸，L-赖氨酸，L-酪氨酸。根据所测供试品和对照品的各种氨基酸色谱图，以外标法分别计算出十八种复合氨基酸注射液中各组分氨基酸的百分含量。
本发明只需要采用常用的高效相色谱仪和其它通用器具，用2.4-二硝基氟苯作衍生试剂即可完成检测，与采用价格昂贵的氨基酸分析仪，或者成套高效液相色谱法柱后、柱前装置相比较，本发明能够节省检测费用。本发明能在30分钟内完成对十八种复合氨基酸注射液的定量检测，并且具有分析范围广，分析周期短，操作方便的特点。另外，由于本发明最大检测误差不超过5%，测量精度小于2%，因此，本发还具有检测准确度高，重现性好的优点。
本发明的具体检测方法由以下的实施例给出。
精确取供试品和对照品分别加水制成一定浓度的溶液，检测试验分别进行，各精确量取1-2ml的溶液置于10ml容量瓶中，加0.5mol/l浓度，PH9的碳酸氢钠溶液1ml，加2.4-二硝基氟苯10ul，乙腈1ml，振摇均匀。置60℃水浴中暗处加热60分钟后取出，加PH7.0的磷酸二氢钾缓冲液至刻度，振摇均匀。取10ul定量稀释后的衍生产物二硝基苯氨基酸，经进样阀直接注入高效液相色谱仪的碳-18反相分析柱。同时，将梯度洗脱剂流动相A和流动相B以流速1ml/min按下列流动相程序由梯度泵送入进样阀，即流动相A和流动相B在0-30分钟内的浓度比在16∶84至98∶2之间逐渐变化。经高效液相色谱仪的碳-18反相分析柱进行色谱分离。各氨基酸衍生物与反相柱填料相互作用，使各种氨基酸得到分离。经碳-18反相分析柱完成色谱分离，色谱分离后的各种氨基酸经紫外-可见分光光度检测器作定量检测，检测电信号送入电脑积分仪进行数据处理，并且在记录纸带上依次画出各种氨基酸色谱图。该色谱图分离出的各氨基酸顺序是L-天门冬氨酸，L-谷氨酸，L-丝氨酸，L-甘氨酸，L-苏氨酸，L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-缬氨酸，L-蛋氨酸，L-胱氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-色氨酸，L-苯基丙氨酸，L-组氨酸，L-半胱氨酸，L-赖氨酸，L-酪氨酸。根据所测供试品和对照品分别表示的各种氨基酸色谱图，以外标法分别计算出十八种复合氨基酸注射液中各组分氨基酸的百分含量。
权利要求
1.十八种复合氨基酸注射液的高效液相色谱法测定方法，其特征在于在柱前衍生化过程中要加注1毫升乙腈，振摇均匀，置于60℃水浴中暗处加热60分钟后取出，加PH7.0的磷酸二氢钾缓冲液稀释至刻度，再振摇均匀，在梯度洗脱剂过程中以流动相A和流动相B为梯度洗脱剂，并且采用流动相A和流动相B在0-30分钟内浓度比在16∶84至98∶2之间逐渐变化的流动相程序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是流动相A为乙腈溶液，浓度比为1∶1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是流动相B为醋酸钠和醋酸缓冲液，浓度为0.05mol/l，PH值为6.4，并且含有1%的N，N-二甲基甲酰胺。
全文摘要
本发明涉及药品检验专业的十八种复合氨基酸注射液的高效滚相色谱法测定方法，它采用高效相色谱仪，以2，4-二硝基氟苯作衍生试剂，用柱前衍生化法对十八种复合氨基酸注射液进行定量测定。本方法采用定量稀释技术配制检测液，在检测过程中采用了一定浓度和pH值的流动相A和流动相B作梯度洗脱剂。本方法仅在常用的高效液相色谱仪上一次完成十八种复合氨基酸注射液的定量检测过程，具有节省检测费用，分析周期短，操作方便，分析范围广，准确度高，重现性好的特点。
文档编号G01N30/02GK1053128SQ90100069
公开日1991年7月17日 申请日期1990年1月4日 优先权日1990年1月4日
发明者陈娅兰, 付宜和 申请人:宜昌市药品检验所