专利名称：检测、直接基因分型人单纯疱疹病毒dna的引物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用DNA合成仪制备三条能检测、直接基因分型人单纯疱疹病毒(HSV)的DNA的引物的方法，属生物化学试剂制备的技术领域。
HSV可导致胎儿或新生儿畸形、致盲及性病，其感染率极高。新生儿HSV发病率为13.8/十万，死亡率高达65%。已有的一种检测、直接基因分型HSV的DNA的引物的制备方法是 H.Kimura等人提出的(见H.Kimura 等人的题为‘Detection and Direct Typing of HSV by TCR’一文，载于‘Medical Microbiology and Immunology’1990，No.179，177～184)，用该法合成的引物虽能检测、直接分型HSV，但其多聚酶链反应体外DNA扩增过程耗时较多，达3.7小时，且分型的特异性较低，不具准确性。
本发明的目的是提供一种用DNA合成仪制备的三条引物的方法，使得能快速、简便、特异、敏感的检测、直接基因分型HSV。
图1是美国Applied Biosystems 公司出品的381 A 型DNA合成仪的外型示意图，其中1-10是试剂瓶，11是电源插头，12是电源开关，13是控制面板，14是键盘，15是显示屏，16是机壳，17是散热孔，18是反应柱，19是引物收集管，20是主程序按钮。
制备DNA的引物时，一般总采用DNA合成仪，用本发明制备三条能快速检测、直接基因分型人单纯疱疹病毒DNA的引物，DNA合成仪为美国Applied Biosystems 公司出品的381A型DNA合成仪，制备步骤可说明如下第1步，设计引物顺序。从由上万及至数十万个核苷酸残基组成的人单纯疱疹病毒DNA中，找到最为合适的核苷酸残基排列顺序片段;根据核苷酸残基配对原则，写出与上述片段互补的核苷酸残基排列顺序作为引物中核苷酸残基的排列顺序，即引物顺序。执行本步骤时，无简便方法可循，只能靠知识，经验和实验。实验指利用DNA合成仪找到的大量引物顺序和下述6个步骤合成大量引物，再从能否检测、分型人单纯疱疹病毒感染和多聚酶链反应体外DNA扩增过程耗时长短二个方面对新合成的引物进行筛选。工作量极大。本发明人共筛选出三条引物顺序，它们是，HDP-B5’-CACGTGTACGACATCCTGGAG-3’HDP-15’-CTGGGCTAGCGTGTTGTTC-3’HDP-25’-AGACGCGGTAGTACAGGGTC-3’其中A、G、C和T分别表示脱氧腺嘌呤核苷酸残基，脱氧鸟嘌呤核苷酸残基，脱氧胞嘧啶核苷酸残基和脱氧胸腺嘧啶核苷酸残基。
第2步，接通电源。把381A型DNA合成仪的电源插头11插入交流市电插孔，该仪内的微机因得到供电而工作。
第3步，装注原料。把作为原料的试剂脱氧腺苷二异丙基磷酰胺、脱氧鸟苷二异丙基亚磷酰胺、脱氧胞苷二异丙基亚磷酰胺、脱氧胸苷二异丙基亚磷酰胺、TCA(三氯醋酸)、I2(碘)、四唑、DMAP(二甲基氨基吡啶)、乙酸酐和乙腈分别注入，并注满试剂并1～10。试剂并1～10的容量为25毫升。上列10种试剂均为美国Applied Biosystems 公司的产品。
第4步，键入引物顺序。利用351A型DNA合成仪控制面板13上的主程序按钮20和键盘14，键入所需制备引物内的核苷酸残基排列顺序。键入的引物顺序示于显示屏15，制备引物HDP-B时，键入的引物顺序为5’-CACGTGTACGACATCCTGGAG-3’。制备另2种引物时，键入的引物顺序可依次类推。
第5步，键入反应时间，利用351A型DNA合成仪控制面板13上的主程序按钮20和键盘14，键入所需制备引物的反应时间。键入反应时间(分)示于显示屏15，制备1微摩尔数(μmol)的引物HDP-B、引物HDP-1、引物HDP-2，键入反应时间分别为240、209、228分，即4、3.5、3.8小时。
第6步，接通工作电源。按一下电源开关12，381A型DNA合成仪的引物合成部分得到供电，在微机的控制下，使原料在反应柱18中自动合成所需引物。引物合成部分工作时会发热，热量通过位于机壳16两侧的散热孔17散出。
第7步，收集成品。在反应柱18中合成的所需引物(成品)经橡皮管引出，滴入专用收集成品的引物收集管19。
由于经过以上7步只能制备成一种所需引物，所以三条能检测、直接基因分型人单纯疱疹病毒DNA的引物需要分3次制备。
与已有技术相比，本发明有以下优点1.用本发明合成的三条用于检测、直接基因分型人单纯疱疹病毒DNA的引物的多聚酶链反应体外扩增过程耗时少，仅1.5小时，而已有技术为3.7小时。加上其他操作，使整个检测与分型工作可在10小时内完成，效率较高。
2.分型的特异性高，准确性高，而已有技术的分型的特异性较低，不具准确性。
本发明为生化试剂合成领域提供了一种能制备三条检测并直接基因分型人单纯疱疹病毒DNA的引物的方法，且用本发明制备的三条引物为医学化验领域及基础理论研究提供了快速检测与分型所需的试剂，因此，本发明在上述领域中将会得到极其广泛的应用。
权利要求
1.一种用DNA合成仪制备三条能快速检测、直接基因分型人单纯疱疹病毒DNA的引物的方法，制备步骤包括设计引物顺序、接通电源、装注原料、键入引物顺序、键入反应时间、接通工作电源和收集成品7步，其特征在于在键入引物顺序步骤中键入设计引物顺序步骤中找到的引物HDP-B或引物HDP-1或引物HDP-2的引物顺序，即5’-CACGTGTACGACATCCTGGAG-3’或5′-CTGGGCTAGCGTGTTGTTC-3’或5’-AGACGCGGTAGTACAGGGTC-3’；分3次合成的三条引物引物HDP-B、引物HDP-1和引物HDP-2，引物顺序分别为5’-CACGTGTACGACATCCTGGAG-3’、5’-CTGGGCTAGCGTGTTGTTC-3’和5’-AGACGCGGTAGTACAGGGTC-3’；在键入反应时间步骤中制备1微摩尔数(μmol)的引物HDP-B、引物HDP-1、引物HDP-2所对应的键入反应时间分别为240、209、228分，即4、3.5、3.8小时。
全文摘要
本发明涉及一种用DNA合成仪制备三条能检测、直接基因分型人单纯疱疹病毒(HSV)的DNA的引物的方法。本发明所合成的三条引物组成的反应体系对HSV进行检测与基因分型具有快速、敏感、特异、简便等优点，为医学化验及基础理论研究提供一种崭新的试剂和检测、分型方法。
文档编号G01N33/531GK1084854SQ92108590
公开日1994年4月6日 申请日期1992年9月30日 优先权日1992年9月30日
发明者陈诗书, 徐文波 申请人:上海第二医科大学