专利名称：检测液体样品中溶血的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测全血样品中溶血的方法，确定全血样品中钾离子浓度升高的方法，检测液体样品中溶血和/或确定钾离子浓度升高的装置，检测全血样品中溶血和/或确定全血样品中钾离子浓度升高的装置，以及包括多个微装置之生物传感器的一次性使用套筒，所说的装置进一步包括溶血检测单元。
背景技术：
在生物液体中许多分析物以显著不同于其在红血细胞中的浓度存在。例如，完整红血细胞内钾离子浓度通常约为150mM，而正常病人血浆部分中的钾浓度一般约为4.0mM。
处理细胞或含细胞之生物液体样品的操作有时可能导致细胞破裂，这种现象一般称为“裂解”。对红血细胞来说这种现象是特别常见的。当完整红血细胞受到物理损伤并破碎时，这种现象称为“溶血”。例如，当从病人体内抽出血液样品时即可发生溶血。溶血导致含有相对高浓度钾和血红蛋白(相对于其他分析物)的红血细胞内容物与血液样品的血浆部分混合。
溶血在血液样品中是常见的，并且在血液接触异体表面时便可发生溶血。特别是在心脏手术或心脏旁路架桥期间，进行输血或体外循环时，溶血现象可能是不可避免的。也可因不适当的抽取或处理生物液体标本，甚至在离心和分离过程中造成溶血。因此，临床化学工作者必须知道溶血对医生指令的分析是否会产生影响。许多实验室拒绝所有的溶血标本，而没考虑这种方法是否合理。
例如在临床医学中，通过检测全血的血浆部分中的钾浓度来确定全血样品中的钾浓度。但事实上红血细胞内的钾浓度可以比血浆中的钾浓度高25至75倍，只有很少红血细胞溶血就会导致血浆部分中钾浓度人为地升高。
医学中，一般只有血浆部分中的钾浓度对于确定病人的电解质平衡才是重要的。利用血浆部分中的钾浓度来确定例如钠/钾平衡，以作为适当神经传导及医学领域中已知的急性健康问题相关的其他基本状况的重要指征。因此，取样期间溶血可导致过量估计真实血浆钾浓度。如果病人真的有低血浆钾则问题将是特别严重的，因为低血钾需要作紧急处理。在这种情况下，小数目的溶血红细胞可以使血浆钾浓度升高到正常范围，致使病人得不到必要的紧急处理。
除了钾以外，溶血对于乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶浓度的测定结果也有很大影响，并且当严重溶血时可观察到胆固醇水平升高。
红细胞(红血细胞)含有大约比血浆多160倍以上的乳酸脱氢酶、68倍以上的酸性磷酸酶、40倍以上的天冬氨酸氨基转移的(Caraway，Chemical and diagnostic specificity of laboratorytests.Am.J.Clin.Pathol.，1961，37445-64)。乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶是临床上最重要的酶，其可因溶血而显示明显增加。前列腺酸性磷酸酶(酒石酸抑制的酸性磷酸酶)也受溶血的影响。据信酒石酸可能并不抑制因溶血造成的酶活性增加(参见Yucel et al.，Effect on in vitro hemolysis on 25 common biochemical tests.Chinical Chemistry，1993，38575-577)。
为此，静脉采血人员和其他负责采取血样医务工作者应掌握尽可能减小溶血的技术。例如，已知当借助手指或愈合棒挤压采血位点促进血流以得到样品时可引起溶血，并应避免之。
确定血样是否有明显溶血的常规临床化学实验室方法是在离心机中离心样品，将血浆部分与红血细胞分离开，然后由眼检查血浆部分。溶血导致血浆部被血红蛋白污染，而使黄色血浆呈现明显的红颜色，在典型临床化学实验室中，实际上所有血液试验都是基于血浆检测完成的。因此，离心血液样品是一种在临床实验室中确定溶血的令人满意的方法。
如果已知由医生指令的试验可能因溶血受到干扰的项目(如钾、乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶；参见Yucel et al.)并且结果不正常，就应由实验室技术人员检查血浆样品的颜色。如果血浆部分显示有溶血证据，一般者应重新采取血样。
虽然溶血的影响是方法依赖性的(Frank et al.，Effect of invitro hemolysis on chemical values for serum.Clin.Chem.，1978，241966-70)，但既使只是稍有溶血，也必须拒绝乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶、前列腺磷酸酶和钾的分析结果。
可以使用血浆游离血红蛋白(Hb)浓度作为溶血的度量标准(Yucel et al.)。例如，当血红蛋白浓度超过20mg/dL或大于3.1Amol/L时血清或血浆即显示可见的溶血证据(Caraway，supra；Sonntag et al.，Haemolysis as an interference factor in clinicalchemistry.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，1986，24127-139)。溶血对于红细胞中的低于血浆中浓度存在的成分影响很小，但对在红细胞中以高于血浆中浓度存在的成分则可见有显著的影响(Sonntag et al.，supra；Frank et al.，supra；Brydon et al.，Theeffect of heamolysis on the determination of plasma constituents.Clin.Chem.Acta，1972，41435-438)。当使用某些对Hb的氧化作用敏感的颜色试剂提供是否存在某种成分和/或某浓度的可见指征时，Hb也可能干扰该成分的比色测定结果。
除了上述分析物(钾、乳酸脱氢酶、胆固醇、前列腺磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶)之外，生物液体样品中的醛缩酶、总酸性磷酸酶、异柠檬酸氢化酶、镁及磷酸盐的浓度或活性也可因溶血而增加。
例如当生物液体是全血时，相应血浆部分中的无机磷酸盐浓随着细胞中有机酸被水解而迅速增加。每分升(dL)生物学液体样品中，每10mg血红蛋白(Hb/dL)增加天冬氨酸氨基转移酶活性近2％。当未经提取使用比色法时，10mg Hb/dL将使表观胆固醇浓度增加5mg/dL。每分升生物学液体样品中的10mg血红蛋白将使血清乳酸脱氢酶增加约10％，血清钾增加约0.6％(参见Tietz，“Textbook of Clinical Chemistry”，W.C.Saunders and Co.(1986)，pp.488)。
检测尿中血红蛋白存在的方法和检测条是已知的(HEMASTIXTM，Miles Ames.Elkart，Indiana生产)。但HEMASTIXTM试验只是半定量的。另外，在HEMASTIXTM试验中不必区分红血细胞和Hb，因此在使用HEMASTIXTM条之前也不需分离红血细胞。再者，尿液通常有酸性pH，而血液血清或血浆pH为7.4。因此，用于检测尿中是否存在Hb方法和检测条没有达到检测全血中溶血现象之方法和装置的要求。
使用从红细胞和白细胞中或从全血中分离血浆或血清的材料，从全血中分离血浆或血清的方法也是已知的(美国专利4,477,575和4,816,224)。然而，这些方法和装置尚没有被用于检测由于红血细胞溶血造成的血红蛋白的存在或血液分析物浓度的升高。
目前，在用任何一种(1)处理全血的，并且(2)在不便利用离心机的病人床边使用的分离试验时，尚没有一种用来确定血液样品是否发生溶血的实用方法。
本发明试图建立一种用于鉴定血液样品的简单方法和装置来解决这一问题，所说的样品中已发生溶血达到足以导致错误的检测血浆分析物浓度或活性的水平。
发明的描述因此，本发明的一个目的是提供一种检测生物学液体样品中溶血现象的新方法和装置，其定量地确定是否有足够数目或浓度的完整红血细胞已发生溶血从而提高继后使用生物学液体样品进行的分析物检测水平。
本发明的再一个目的是提供一种检测全血样品中溶血现象的新方法和装置，其定量确定是否有足够数目或浓度的完整红血细胞已发生溶血而致使提高继后使用生物学液体样品进行的分析物检测水平。
本发明的再一个目的是提供一种估测生物学液体样品中溶血水平、或每单位体积溶血红血细胞数目的新方法或装置。
本发明的再一个目的是提供估测全血样品中溶血水平或每单位体积溶血红血细胞数目的新方法或装置。
本发明的再一个目的是提供估测生物学液体样品中由于溶血而导致的钾离子浓度升高的新方法和装置。
本发明的再一个目的是提供估测全血样品中由于溶血而引起的钾离子浓度升高的新方法和装置。
本发明的再一个目的是提供包括多个微装配的生物传感器的一次性使用套筒，其定性和/或定量地确定因溶血引起的分析物浓度升高，其中分析物在完整红血细胞中有相对高的浓度并在血浆部分中有相对低的浓度。
已由用于检测生物学液体样品中溶血的新方法和装置提供的这些和其他一些目的，将在下文对本发优选实施方案的详细描述中变得列加清楚，其中所说的方法包括(a)使含有完整红血细胞的全血与干燥分离材料接触，所说的分离材料具有将完整红血细胞分效地与含有可能存在于所说样品中的细胞外血红蛋白的部分分离的物理特性；(b)使所说的样品与所说的材料保持接触一段足以发生所说的分离的时间；并且(c)检测所说部分中细胞外血红蛋白是否存在，并且其中所说的装置包括(a)可以在其上面施加液体样品的干燥分离材料，所说的材料具有有效分离所说样品之一部分的物理特性，所说的部分将含有可能存在于所说样品中的典型浓度的任何细胞外血红蛋白；以及(b)确定所说部分中所说细胞外血红蛋白浓度的检测工具。
附图的简要描述当结合附图阅读下文给出的详细描述时，将会容易地获得对本发明及其许多附带优点的更全面的了解，其中
图1显示本发明装置的实施方案；图2显示本发明装置的第二个实施方案；图3显示本发明装置的第三个实施方案；其适用于本发明一次性使用套筒的实施方案；图4A和4B显示其中装有产色试剂和“终止”或灭活试剂的本发明溶血检测部件的实施方案；图5是利用图3之溶血检测部件的本发明一次性使用套筒的顶面观；图6A是图5所示一次性使用套筒的侧面观，图6B是其中利用的图3所示溶血检测部件的放大的侧面观；图7是其中装有根据图2之改进的溶血检测部件的本发明一次性使用套筒的顶面观；图8是图7所示一次性使用套筒的底面观；及图9A显示图7中所示一次性使用套筒的侧面观，图9B显示其中所附溶血检测部件的放大的详细结构。
实现本发明的最佳方式本申请中，术语“全血”是指在其凝固前被试验的新抽取的血液；或者是常规抽取的血液样品，其可被抽入真空器内，并可含有抗凝剂例如肝素锂等，或者可在常规临床检验中向其中加入一种或多种其他标准临床制剂。
术语“大约”一般是指临床化学领域中已知的各种分析物的实验测定值的合理预期的波动。依据所用技术的精确度和敏感性，这种合理预期的波动可能是不同的。
本发明中“血清”或“血浆”是指与红血细胞分离开的全血的部分。“血清”一般是指已在其中加入了一种或多种抗凝剂如肝素锂的全血(抗凝全血)，并且已除去了其中的红血细胞的部分。在医学和临床领域中一般是使用血清检测分析物。“血浆”一般是指已加抗凝剂的，但还没有除去红血细胞的全血的部分。在医学和临床技术中一般是使用血浆经静脉内输注来代替病人的血液。
在本申请中，术语“升高”是指分析物的浓度增加至在没有发生溶血时本已存在于该部分中的浓度以上。
I.检测全血样品中溶血的方法医学和临床技术需要有一种快速检测生物学样品是否含有溶血之红血细胞的，但又不需使用离心机的方法。对于检测全血样品中是否存在分析物或其浓度的方法来说，这种需要特别强烈。因此，本发明包括检测全血样品中溶血的方法，该方法包括以下步骤(a)使含有完整红血细胞的全血样品与干燥分离材料接触，所说的材料具有将一个含有可能存在于样品中的细胞外血红蛋白的部分与完整红血细胞分离开的物理特性；
(b)使样品与所说的材料保持接触一段足以发生分离的时间；并且(c)检测该部分中细胞外血红蛋白的存在。
在本方法中，与完整红血细胞分离开的部分包括血浆和血清。可以稀释、用溶剂或试剂处理样品，或向其中加入内部标准品，只要这些处理不在化学上修饰分析物或影响待分离部分的分离行为即可。例如，可以加入生理盐水以稀释样品。但不应向样品中加去离子水，因为去离子水加入全血中会导致溶血。
该方法中的检测步骤可包括肉眼观察该部分是否存在某种色调。在本发明的这一实施方案中，该色调相当于大约20mg/dL的估计的细胞外血红蛋白浓度，其相等于每μL全血裂解大约100个红血细胞。如上所述，当血红蛋白浓度超过20mg/dL，导致颜色从黄变成红或粉红时血浆即显示肉眼可见的溶血证据(Tietz，pp.488)。
II.通过将分离部分的颜色与外部色调标准相比较以估计全血样品中血红蛋白浓度的方法本发明还包括通过将被分离部分的色调与图表上的许多不同色调相比较，以估计全血样品中Hb浓度，及相应的全血样品中每单位体积溶血红血细胞数目或溶血红血细胞浓度的方法。图表上展示有许多特征性色调，其相当于与血浆中预定Hb浓度范围相联系的颜色。因此，该方法可进一步包括将被分离部分的色调与展示不同色调的颜色表相比较，其中各色调是估测的存在于给定被分离部分中的细胞外血红蛋白浓度的指征。
或者，该检测步骤可包括使分离的部分与产色试剂接触。使可能存在于被分离部分中的细胞外血红蛋白与产色试剂反应以提供颜色改变。颜色最好是肉眼可检出的。
该实施方案中血红蛋白的检测取决于血红蛋白的催化过氧化物还原的过氧化物酶活性。该反应需要有机过氧化物和氢供体(还原的色素原)。这样的分子包括邻甲苯胺、愈创树脂、二异丙基苯过氧化二氢和四甲基联苯胺。与Hb反应后，被氧化的色素原产生所需的颜色改变。
可依据分离的部分通过分离材料的速率和分离部分与产色试剂及灭活剂的接触情况，以及灭活剂与产色试剂通过分离的部分进行扩散以彼此反应的速率，在经过一段时间后用灭活剂使产色剂灭活。该实施方案提供终点检测(“终止”)，所以Hb的浓度与一定时间后所显现的最后颜色的强度相关。在以时间或速率为基础的“终止”方法中，经过预定时间后，可测定最后颜色的强度，或者也可以进行电化学检测，以确定Hb的浓度。
用于确定血清中胆固醇存在的试剂系统是胆固醇酯酶胆固醇氧化酶-过氧化物酶系统(例如参见美国专利4,477,575和4,816,224中所述)。Hb的过氧化物酶活性干扰这一试验。因此，本发明方法可结合使用美国专利4,477,575和4,816,224中所述的比色分析血清胆固醇的方法，以确定因Hb所致的过氧化物酶活性升高。
邻甲苯胺以很小的量用于商品检测试剂盒(HEMASTIXTM，Miles Ames Company，Elkhart，Indiana)中，该试剂盒用于检测尿中血红蛋白或肌红蛋白的存在。用于本方法该实施方案中的邻甲苯胺的量优选是很小的。
邻甲苯胺对大约2mg Hb/dL尿敏感，分别相当于大约10个红细胞/μL尿或10个红细胞/μL全血。因此邻甲苯胺对Hb是很敏感的(Tietz，pp.1562)。阴性试验(没有任何兰色或发绿颜色)是指在所检验的样品中没有发生明显的溶血。阳性试验(存在兰色或发绿的颜色)是指在被检验的样品中已发生了明显的溶血。更具体地说，阴性试验是指估计的细胞外血红蛋白浓度少于2mg/dL被分离部分，而阳性试验是指估计的细胞外血红蛋白浓度至少为2mg/dL分离部分，或者是指大约每μL全血有10个红细胞已溶血。
为了使试验敏感性达到最佳化，将产色试验剂以渐增量浸于条检测区域。直到所存在的足够产色试剂与可能存在于被分离部分中的任何量的血红蛋白反应。在实现最佳化试验中，分别试验几个含有不同量颜色试剂的检测条。然后可选择在所需时间内提供所期望的显色强度的产色试剂浓度。因此颜色显现不依赖于干燥的分离材料，但取决于溶血的程度。
但如果样品容器已被次氯酸盐溶液污染，或者样品中存在含过氧化物酶的细菌，则可观察到假阳性结果。如果样品中存在游离肌红蛋白或完整的红细胞也可出现阳性结果。因此如下文将要讨论的，使用干燥分离材料将可能含有Hb的部分中与完整红血细胞分离是必要的。但游离肌红蛋白一般只见于得自心脏病发作病人的样品中。因此，可在进行溶血检测前用抗肌红蛋白抗体处理得自已知或推测患心脏药发作病人的血液样品。
另外也可以借助反射仪完成本方法和检测步骤，所说的反射仪提供作为存在于该部分中之细胞外血红蛋白浓度的函数的读数。因此，本方法进一步包括用光照射被分离的部分，并确定由于被分离的部分中存在血红蛋白而引起的光反射度改变的步骤。
当直接检测由于分离的部分中的血红蛋白引起的光反射时(即不存在产色试剂时)，所用照射光的波长可以是血红蛋白表现最大吸收的波长。但一般使用宽带可见光检测反射度。对着白色表面(例如未使用过的干燥分离材料)校准反射度。然后基于灰度判断含分离之血清或血浆部分的干燥分离材料的反射度(例如白颜色越少反射度越低)。另外对具有已知Hb浓度的样品进行的检测可以提供作为定量反射检测之基础的数据点。将反射度对Hb浓度作图。然后使用该图确定以分离部分的反射度为基础的全血样品的分离部分中的Hb浓度。
III.估测全血样品中由于溶血所致分析物浓度升高的方法该方法在检测步骤后可进一步包括估测由于红血细胞溶血所致样品中分析物浓度升高的步骤。在一优选实施方案中，本估测选自下列一组的分析物的浓度升高钾离子、乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶。本方法特别适用于估测由于红血细胞溶血引起的钾离子升高。
在还包括估测样品中分析物升高之本发明方法的实施方案中，该方法可进一步包括在估测步骤之后调节分析物表观浓度，以说明由于红血细胞溶血所致分析物所占比例。
美国专利5,200,051中公开了用于检测和确定各种分析物包括钾之存在和/或浓度的的微装配的生物传感器。
在本发明检测由于全血样品中完整红血细胞溶血引起的血钾离子浓度升高之方法的实施方案中，所说的方法包括
(a)使含有完整红血细胞的全血样品与具有效分离血浆部分之物理学特性的干燥分离材料接触，所说的血浆部分含有可能存在于样品中的，来自完整红血细胞的细胞外血红蛋白；(b)使样品与所说的材料持续接触一段足以完成分离的时间；(c)估测血浆部分中细胞外血红蛋白的量；以及(d)估测样品中由于溶血导致的钾离子浓度的升高。
检测由于完整红血细胞溶血引起的钾离子浓度升高的方法，特别适于确定足以导致比本已存在于没有溶血之全血样品中钾浓度至少升高0.1mM的溶血水平。钾浓度升高0.1mM相当于每μL全血有很小百分比的红血细胞溶血，假定为正常血细胞比容水平(约40％)。
或者，可以在一次性使用全血分析套筒中完成检测由于完整红血细胞溶血引起之钾离子浓度升高的方法，所说的套筒包含干燥分离材料和检测钾离子浓度的离子敏感性电极。钾离子敏感性电极较好是微装配于硅电路片上。
该检测由于完整红血细胞溶血所致钾离子浓度升高的方法还可包括将钾离子浓度升值与预选择的溶血相比较的步骤，并因为临床分析不可靠而拒绝接受升高到预选定值以上的样品。为此，将也可能与上述产色试剂接触的被分离部分的颜色与相当于标准血浆样品之颜色的色调相比较。其中所说的标准血浆样品含有的Hb浓度是由预选定的溶血值造成的。
例如，每μL血清10mg血红蛋白可使血清钾离子浓度升高0.6％(Tietz，p.488)。溶解的红血细胞、Hb浓度和血分析物如钾离子浓度的升高之间的关系是彼此呈线性依赖的。这样，本领域技术人员即可预选择一个相当于已知血浆Hb浓度及其相应颜色的溶血值，该溶血值本身则是与将因不能可靠地应用于临床目的而被排除的预选定的钾离子浓度升高相互关联的。
IV.检测液体样品特别是全血样品中溶血的装置本发明的再一个方面包括检测液体样品中溶血的装置，该装置包括(a)可在其上施加液体样品的干燥分离材料，所说的材料具有有效分离样品的一个部分的物理学特性，所说的部分含有可能存在于样品中的典型浓度的细胞外血红蛋白；以及(b)确定该部分中之细胞外血红蛋白浓度的检测工具。
该装置特别适用于检测含有红细胞的生物学液体样品如全血，或可能含有红细胞的样品如尿中的溶血。该装置最适用于检测全血样品。因此，本发明还包括检测全血样品中溶血的装置，该装置包括(a)可在其上施加有完整红血细胞之全血样品的干燥分离材料，该材料具有将全血的一个部分与完整红血细胞有效地分离开的物理学特性，所说的部分含有可能存在于样品中的细胞外血红蛋白；以及(b)确定该部分中细胞外血红蛋白浓度的检测工具。
所说的干燥分离材料是通过毛细作用将生物学液体与完整红血细胞迅速分离开，并且不引起可见的溶血的干燥材料。术语“毛细作用”是指该干燥分离材料将液体从其被引至干燥分离材料上的部位以径向幅射方式输送到干燥分离材料之其余部位的能力。相反，红血细胞则未能沿着该材料被迅速输送，因此相对被分离的部分其受到干燥分离材料的阻滞。本领域中也将“毛细作用”称为“毛细力”。美国专利4,816,224和4,477,515(第5栏第64引到第6栏第5行)中描述了“毛细作用”，并在美国专利5,096,669(第48-51栏)中描述了“毛细力”。该干燥分离材料最好不含化学干扰物质，并且不能显著地结合生物学液体样品的非细胞成分。
该干燥分离材料较好是使用美国专利No.5,186,543(列为本文参考文献)中所述常规造纸技术形成单层复合纤维低片的几种不同类型纤维的掺和物。另外，该干燥分离材料也可包括其中有一玻璃纤维层的组合物，其可进一步含有如美国专利4,816,224和4,477,575(均列为本文参考文献)中所述的有机聚合物粘合剂。特别优选的干燥分离材料是可购自AhlstromFiltration、商标为CYTOSEPTM的材料。
本发明装置中适于用作干燥分离材料的复合纤维纸片包含玻璃微纤维、纤维素纤维、及合成样品纤维在随机分散纤维基质中混合的掺和物。可以加入合成粘合剂纤维以提高抗拉强度。该复合纤维纸片不会引起溶血，而这是对该干燥分离材料的基本要求。
该干燥分离材料可以是条状的，其大小为长5至50mm，宽1至10mm，厚0.1至3.0mm。干燥分离材料的物理特性包括其具有长10至40mm、宽3.0至7.5mm、厚0.2至1.0mm的大小。长度约2cm和厚度约0.3mm的干燥分离材料可在大约1分钟内进行足够的分离。
如图1中所示，该装置可以进一步包括支持干燥分离材料2的硬基质I。但干燥分离材料最好是有足够强度和刚性的，这样便不需要支持基质。因此，该装置可由干燥分离材料和检测工具组成。
干燥分离材料可以沿着材料的任何空间方向(即长径、宽径和厚度方向)将红血细胞与待分离的液体部分分离开。如图1中所示，当沿着长径方向分离该部分时(箭头所指方向)，将全血样品施加在朝向干燥分离材料的一个末端3的部位。借助干燥分离材料的毛细作用使待分离部分径向转运离开加样部位。当被分离部分达到或接近相对于含加样部分之末端的另一末端4时，即可用检测工具确定血红蛋白的存在或估测溶血程度。
短语“接近末端”或“朝向一个末端”是指在分离的相关方向(长度、宽度或两者)轴上中点与终点之间的定位。定位较好是在轴的终点(干燥分离材料的最外边缘)与沿着该空间轴的1/3距离处某点之间，包括沿着该空间轴的终点和三分之一距离处的点在内。
或者，如图3所示，该干燥分离装置可沿着材料的厚度轴将液体部分与完整红血细胞分离开。在该实施方案中，将全血样品加样于干燥分离材料31的可利用的表面上，借助毛细作用待分离部分沿着干燥分离材料的厚度轴被输送到附着于相反表面上的一层材料32。在该实施方案中，所说的装置可进一步包括一层或多层材料32，该材料(1)不裂解红血细胞，(2)不结合血浆或血清的化学或非细胞成分，并且
(3)有效地阻止看到或检测到全血样品。
美国专利S,186,843、4,816,224和4,477,575中描述了实现这些目的的适用材料。
与检测全血样品中溶血的方法相似，本装置的检测工具可包括展示用来估计存在于给定的分离部分中细胞外血红蛋白浓度的至少一种色调的有色图片。
该检测工具也可包括与细胞外血红蛋白反应的产色试剂，借以提供颜色改变。因此，如图1中所示，该装置可进一步包括浸有产色试剂的，定位在干燥分离材料之一个末端或其附近的试剂垫5。开者，如图3中所示，可包括铺层于干燥分离材料之表面上的试剂垫32。
另外，也可将产色试剂直接加于干燥分离材料上。在这种情况下，可将产色试剂溶解于某种适当的溶剂中，例如经喷雾或浸渍施加于干燥分离材料上，然后再干燥所说的分离材料。将颜色试剂4施加于干燥分离材料上的技术是常规的，并且是本领域技术人员已知的。溶剂可以包括有机溶剂如丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙醇等，如果颜色试剂是水溶性的，则溶剂可以是蒸馏的去离子水或适当的缓冲剂如标准磷酸盐缓冲剂。当然，必要时也可以使用水和水溶性或水混溶性有机溶剂。
当使用干燥分离材料以长或宽方向分离完整红血细胞和液体部分时，可以将产色试剂施加于与施加全血样品的部位相对的干燥分离材料的另一端。或者，当沿着其厚度方向用干燥分离材料分离完整红血细胞和液体部分时，可将产色试剂施加于干燥分离材料的与施加全血样品之表面相反的表面上。
因此，本装置可由干燥分离材料、定位于干燥分离材料之一个末端或一个表面上的产色试剂，及检测工具组成。
如图2中所示，本装置中可配备其附近有检测工具7的观察区6。可设计该观察窗使得基本上看不到被分离样品含有完整红血细胞的部分(参见图2)。观察区的位置较好沿着分离材料有足够的距离并离开加样的位点，以使红血细胞不会达到观察区。
或者，如图4A和4B中所示，可将产色试剂与“终止”Hb与产色试剂反应的灭活剂合用。灭活剂可位干燥分离材料上或附着于其上面的垫中，例如在离开施加全血样品之位置43的距离比含产色试剂之位置42更远的位置41处(图4A)。或者灭活剂的位置41可以沿着干燥分离材料与产色试剂的位置42有相同的距离(图4B)。
V.一次性使用溶血检测套筒本装置特别适用于作为一次性使用套筒，因此如图2中所示其可进一步包括环绕干燥分离材料的容器及用于引入样品的小孔9。该一次性使用套筒还可进一包括封闭小孔的工具。例如，如图5中所示，可在通过小孔9导入全血样品后，使用可弯曲绞链52上的可密封帽51密封该小孔。图6A显示处在接近的位置中的帽51、绞链52和套筒小孔53。
该一次性使用套筒是可丢弃的并且是自身包含的，检测时只使用很小量的血液。例如，在本一次性使用套筒中只使用10至100微升，更好是大约60微升血液。因此，本一次性使用套筒对个人操作该套筒和对于环境来说，都可使接触被污染之全血样品的危险达到最小程度。
VI.进一步包括比色图片的溶血检测装置在一优选实施方案中，如图2中举例显示的本装置还包括一个位于窗口视野内的比色图片7，该比色图片展示至少一种指示估计的存在于给定之血浆部分中的细胞外血红蛋白浓度的色调。该色调与血浆部分中预定的钾浓度升高相互关联，所说的升高较好为每升至少0.5毫摩尔，最好为每升至少0.1毫摩尔。
在图2所示装置的进一步的优选实施方案中，比色图片至少包括两种色调，与上述估测全血样品中Hb浓度的方法相似，其中每种色调均为估计的给定血浆部分中细胞外血红蛋白浓度的指标。例如，与小于20mg/dL的Hb浓度相关联的黄色可指示为可接受的样品，而与大于20mg/dL的Hb浓度相关联的粉色则可指示为不可靠的样品。但为了进行半定量估测，比色图片可包括3至12种色调。
在本发明的进一步的实施方案中，本装置的检测工具可包括一个其中有光源和光检测器的反射度计，定好光源的位置以使来自光源的入射光束投向被分离的部分以提供反射光束，并定好光检测器的位置以允许检测反射的光束。
VII.检测溶血和检测血或其他液体中分析物的一次性使用套筒本发明的一次性使用溶血检测装置可以是独立的或者可置入能够对血液或其他液体进各种电化学检测的可丢弃的装置及手持式读数器中。一种极其有用的对血液或其他液体进行各种电化学检测的床边分析系统是基于微装配之生物传感器的，如美国专利5,096,669和美国设计专利337,164(而者均列为本文参考文献)中描述的i-STAT系统(由I-Stat Corp.，Princeton，N.J.生产)。因此，本装置适合用于微装配了生物传感器的系统如i-STAT系中。
如图5中所示，一小部导入i-STAT装置中的血液进入套筒小孔53。帽51置于套筒小孔53上，从而使干燥分离材料31与小孔中的全血样品接触。借助毛细作用从全血样品中分离血浆和血清部分，通过干燥分离材料31并接触到一层可浸有产色试剂的检测材料32。
如前所述，图6A中显示了该装置的端视图。图6B是本发明该实施方案中帽51、套筒小孔53和溶血检测部件(干燥分离材料31和肉眼观察材料层32)的侧视图。借助一个包绕着干燥分离材料31和肉眼观察材料层32的橡胶或塑料O形环61以造成不透气密封，以使包括多个微装配之生物传感器的i-STAT套筒保持适当功能。
因此，本发明进一步包括一种一次性使用的套筒，其中排布有多个微装配的生物传感器，用以确定全血样品中一种或多种生理学分析物的存在或浓度，该装配进一步包括溶血检测单元，其中包括(a)可在其上施加一部分全血样品的干燥分离材料，该材料具有可效分离样品之一个部分的物理学特性，所说的部分应含有可存在于样品中的典型浓度的细胞外血红蛋白；以及(b)用于确定该部分中细胞外血红蛋白之浓度的检测工具。
微装配的生物传感器较好包括用于确定样品中钾离子浓度的微装配的钾离子选择性电极和参考电极。此外，在该实施方案中，可使用反射计代替人肉眼观察以更准确地定量血红蛋白浓度，并因而确定血浆分析物浓度的升高。在该实施方案中，例如准确定量检测血红蛋白即可校正用i-STAT钾离子选择性电极完成的钾离子浓度检测。
i-STAT钾离子选择性电极的分辨率是以可靠地报告钾浓度达到±0.1mM的精确度。因此，设计本发明一次性使用套筒以检测足以使全血样品之血浆部分中钾浓度升高至少0.1mM的溶血。
在另一实施方案中，为了让使用者容易定量读数，本装置可直接装配到如图7中所示i-STAT一次性使用套筒的套筒外壳72中，或靠近之。在图7所示的装置中，为在其中使用而将图2的溶血检测部件稍加改进。改进基本上包括将图2所示的容器9换成图7所示的一次性使用套筒外壳72。
在该实施方案中，将全血样品导入直接位于溶血检测装置样品小孔71上方的套筒小孔73中。盖上帽74后，使全血样品通过溶血检测装置样品小孔71，在此处样品接触干燥分离材料2的一端。借助毛细作用沿着干燥分离材料2从全血样品中分离出血浆或血清部分，使之最终接触目视检查区6。目视检查区6紧上方(见图7)和目视检查区6下方(见图8)的套筒外壳中的窗口使得能够观察检测结果。按照本发明包括上述有色图片的实施方案，可以配有比色图片77(图7)或87(图8)。
图9显示图7和8的一次性使用套筒的侧视图。在图9的装置中，使全血样品与干燥分离材料92接触的溶血检测装置样品小孔91正好位于血样入口密封垫之上。血浆或血清部分沿着干燥分离材料92虹吸，因而逐渐与全血细胞分离开。在该实施方案中，排气孔93对于当血浆或血清通过干燥分离材料时允许空气从中排出是必要的。为方便起见，目视检查窗口94定位在套筒外壳95的底面上，从而与图8中所述的实施方案相对应。
如美国专利5,096,669中所述，一次性使用套筒包括多个微装配的插入读数器中的生物传感器，借以检测血液样品中分析物的浓度。因此，可在将一次性使用套筒插入读数器中之前或之后使用溶血检测装置目视检验分离的部分。
基于对下列举例说明性实施方案的描述将更深入了解本发明的其他特征。这些实施例在于举例说明而不是限制本发明。
实施例1将加肝素锂的血液冷冻1小时后融化以裂解红血细胞。然后将肝素锂血液的等分样品以是可在血浆部分中提供一定Hb浓度范围的量加到未溶血的全血样品中。然后彻底混合样品。以这种方法制备具有正常钾水平(约4mM)和因溶血钾浓度升高0.1mM到10mM的样品。然后在Beckman-Astra自动分析仪(BackmanInstruments)上检测各样品离心的血清部分中的钾浓度。还使用i-STAT6+套筒和手提式临床分析仪(i-STAT，Princeton，N.J.)检测各全血样品的钾浓度。以这种方法，有可能制备离心后检查血清而具有可见的溶血信号的样品，但仍可测到与没有可见的溶血信号样品相同的钾浓度(即钾升高小于0.1mM)。这是因为钾浓度改变小于0.1mM代表了Backman-Astra自动分析仪和i-STAT系统的分辨率。
实施例2使用当毛细吸取血液时阻滞红血细胞的CYTOSEP滤纸(可购自Ahlstrom Filtration，Inc.)设计用于检测全血中溶血的简易装置。将CYTOSEP滤纸切成大小为25×5mm的条。将按实施例1所述方法制备的一滴全血样品(约50μL)加在各条的一端。因为含有红血细胞的样品沿着各纸条虹吸，血浆走在红血细胞的前面从而得以被分离。在血浆部分达到终点时，红血细胞只沿着纸条通过约5-10mm。含有溶血血液的样品当分离了红血细胞时血浆部分呈现明显的红色调，而未溶血的样品则没有呈现明显红色调，而仍为黄色。试验了所有可获得的不同级别的CYTOSEP，均得到相似的良好结果。该实验证明，易于观察到足以导致至少0.1mM的钾浓度升高的溶血。
实施例3重复实施例2的实验，不同的是将比色检测血红蛋白之过氧化物酶活性的试剂浸入CYTOSEP滤纸上与加全血样品位置相反一端的区域中。该试剂包括邻甲苯胺及四甲基联苯胺与二异丙基苯过氧化二氢的混合物。浸渍试剂的滤纸条也给出分离红血细胞和血清部分的良好结果，并且由于显现兰-绿颜色所以比不含产色试剂的纸条能更清楚地目视检查溶血样品。
很显然，有可能基于上述内容对本发明作出许多改动和修饰。因此，应明确的是，在本发明所附权利要求的范围内，可以以不同于本文所作具体描述的方式实现本发明。
权利要求
1.检测全血样品中溶血的方法，其包括(a)使含有红细胞的全血样品与干燥分离材料接触，所说的材料具有有效地将完整红血细胞与含有可能存在于所说样品中的细胞外血红蛋白的部分分离的物理学特性；(b)使所说的样品与所说的材料保持接触一段足以进行所说分离的时间；以及(c)检测所说部分中细胞外血红蛋白的存在。
2.权利要求1的方法，其中所说的部分包括血浆。
3.权利要求1的方法，其中所说的检测步骤包括目视检查所说部分是否存在某种色调。
4.权利要求3的方法，其进一步包括将所说的色调与展示不同色调的比色图片相比较，所说色调各自指示存在于给定的分离部分中的估测的细胞外血红蛋白浓度。
5.权利要求4的方法，其中估测的细胞外血红蛋白浓度至少为2mg/dL。
6.权利要求4的方法，其中估测的细胞外血红蛋白浓度至少为20mg/dL。
15.权利要求1的方法，其中所说材料的物理学特征包括其大小为长5至50mm，宽1至10mm，厚0.1至3.0mm。
16.权利要求2的方法，其中所说的部分是借助所说干燥分离材料的毛细作用与所说的完整红血细胞分离的，其中所说的红血细胞相对于被分离的部分来说受到阻滞。
17.权利要求1的方法，其中所说的干燥分离材料包括玻璃纤维、纤维素纤维和合成织物纤维的复合基质。
18.检测由于全血样品中完整红血细胞溶血引起的钾离子浓度升高的方法，其包括(a)使包括完整红血细胞的全血样品与干燥分离材料接触，所说的材料具有将完整红血细胞与含有可能存在于所说样品中的细胞外血红蛋白的血浆部分有效分离的物理学特性；(b)使所说的样品与所说的材料保持接触一段足以进行所说分离的时间；(c)估测所说血浆部分中细胞外血红蛋白的量；以及(d)估测所说样品中由于溶血导致的钾离子浓度升高。
19.权利要求1或18的方法，所说的方法是在一次性使用全血分析套筒中完成的，所说的套筒包括所说的干燥分离材料和用于检测钾离子浓度的离子选择性电极。
20.权利要求19的方法，其中所说的钾离子选择性被装配在硅电路片上。
21.权利要求15的方法，其进一步包括将所说的钾离子浓度升高与一个选择的溶血值相比较，并排除高于所说预选择值、就临床目的来说不可靠的升高。
22.检测液体样品中溶血的装置，其包括(a)可在其上面施加液体样品的干燥分离材料，所说的材料具有有效分离所说样品之一个部分的物理学特性，该部分应含有可能存在于所说样品中的典型浓度的任何细胞外血红蛋白；以及(b)确定所说部分中所说细胞外血红蛋白之浓度的检测工具。
23.权利要求22的装置，其中所说的液体样品是全血。
24.权利要求22的装置，其中所说的液体样品是尿。
25.检测全血样品中溶血的装置，其包括(a)可在其上施加含有完整红血细胞之全血样品的干燥分离材料，所说的材料具有将完整红血细胞与含有可能存在于所说样品中的任何细胞外血红蛋白的部分有效分离的物理特性；以及(b)确定所说部分中是否存在细胞外血红蛋白的检测工具。
26.权利要求22的或25的装置，其中所说的检测工具包括一比色图片，其展示存在于给定的分离部分中估测的细胞外血红蛋白浓度的至少一种色调。
27.权利要求22或25的装置，其中所说的检测工具包括与所说的细胞外血红蛋白反应的产色试剂，借以提供颜色改变。
28.权利要求22或25的装置，其中所说的检测工具包含于与所说的部分接触的观察区。
29.权利要求27的装置，其进一步包括一个导入所说样品的小孔。
30.权利要求22或25的装置，其为一次性使用的套筒。
31.权利要求25的装置，其中所说的样品被分离成可以通过观察窗口观察到的血浆部分，所说的窗口基本上不能观察到被分离样品的含有完整红血细胞的部分。
32.权利要求31的装置，其中比色图片被置于所说窗口的视野内，所说的比色图片展示至少一种指示存在于给定血浆部分中之细胞外血红蛋白的估测浓度的色调。
33.权利要求32的装置，其中所说色调与所说血浆部分中钾浓度升高至每升0.1毫摩尔相关联。
34.权利要求32的装置，其中所说的色调与所说血浆部分中钾浓度升高至少每升0.5毫摩尔相关联。
35.权利要求22或32的装置，其包括至少两种色调，每种色调均指示给定血浆部分中估测的细胞外血红蛋白浓度。
36.权利要求21的装置，其中所说的检测工具包括由光源和光检测器组成的反射度仪，确定所说的光源的位置以使来自光源的入射光束投向所说的部分以提供反射的光束，并确定所说光检测器的位置以充许检测所说的反射的光束。
37.一次性使用的套筒，其包括调整好以检测全血样品中一种或多种生理学分析物之存在或浓度的多个微装配的生物传感器，所说的装配进一步包括由下列部分组成的溶血检测单元(a)其上面可施加一部分所说全血样品的干燥分离材料，所说的材料具有有效分离所说样品之一个部分的物理学特性，该部分应含有可能存在于所说样品中的典型浓度的任何细胞外血红蛋白；以及(b)用于确定所说部分中所说细胞外血红蛋白之浓度的检测工具。
38.权利要求37的一次性使用套筒，其包括用于确定所说样品中钾离子浓度的微装配的钾离子选择性电极和参比电极。
全文摘要
本发明涉及检测全血样品中溶血的方法、确定全血样品中钾离子浓度升高的方法、检测液体样品中溶血和/或确定液体样品中钾离子浓度升高的装置、检测全血样品中溶血和/或确定全血样品中钾离子浓度升高的装置，以及包括多个微装配之生物传感器的一次性使用套筒，所说的装置中进一步包含溶血检测单元。
文档编号G01N33/48GK1135260SQ94194141
公开日1996年11月6日 申请日期1994年9月28日 优先权日1993年10月4日
发明者G·戴维斯 申请人:伊斯塔特公司