使用基于uv光的dna成像细胞术来检测和/或诊断癌症的体外方法
【专利说明】使用基于UV光的DNA成像细胞术来检测和/或诊断癌症的体外方法
[0001]本申请是2007年5月14日提交的题为“使用基于UV光的DNA成像细胞术来检测和/或诊断癌症的体外方法”的中国专利申请200780024364.1的分案申请。
[0002]发明主题
[0003]本发明涉及通过测量细胞核核酸的UV吸收在体外确定人或动物细胞的细胞核内的细胞核核酸的量的方法。
[0004]本发明还涉及基于细胞核核酸的UV吸收的体外检测生物样品中的癌细胞的方法。
[0005]本发明进一步涉及基于细胞核核酸的UV吸收的诊断和/或预测人或动物对象体内癌症的体外方法。
[0006]发明背景
[0007]癌症的早期检测是治疗癌症患者的关键因素。有各种在生物样品中检测癌细胞，并从而诊断已存在的癌症或至少估计未来癌症发展的可能性的可能的选择。这些不同的方法包括癌组织的物理检验、癌细胞的形态特征检测、细胞结构例如膜和细胞核的免疫组化染色及特征鉴定、测量肿瘤特异因子的表达等等。
[0008]检测癌细胞的一种可能的选择是所谓的DNA细胞术(DNA cytometry)，其测量细胞核DNA的量以检测与正常DNA含量的偏离。假设如果一个细胞(作为突变事件的后果)含有比已知标准(已知为非癌性的，即“健康的”或“正常的”类型)更少或更多的DNAJP么DNA含量上的这种偏离可以提示重要的染色体重排及正在进行的癌症发展。
[0009]因此在癌症诊断范围，在科研和临床应用中，通过核酸特异性染色对细胞核DNA进行量化正在越来越多地进入实际应用中。
[0010]通过流式或成像细胞术对细胞核DNA含量进行测量特别基于如下假设:(i)结合至DNA的染料的量正比于存在的DNA的量，和(ii)从染料通过发射、吸收或透射产生的光信号正比于染料的量。
[0011]典型地用于通过DNA成像细胞术(DNA image cytometry)测量细胞核DNA的一种DNA特异性染色方法是一种基于酸的反应，根据Feulgen和Rossenbeck命名，通常简单地称为福尔根反应(Feulgen react1n)。事实上所述福尔根反应是一种生色反应，其中DNA被酸水解产生具有游离醛基的不含嘌呤的DNA(即所谓脱嘌呤核酸(apurinic acid, APA))。这些物质之后与含有共价结合至所述游离醛基的染料的希夫试剂(schiff’s reagent)反应。
[0012]虽然所述福尔根反应对于DNA具有特异性，但是其具有多种缺点。其非常耗费时间，并且是一种复杂精细的反应，需要非常小心地控制并验证以获得可重复的和有意义的结果。普遍用于移除嘌呤碱基的HCl将APA水解为较小片段导致一个问题。APA分子的片段化导致这些片段从细胞核中移除并因此导致丢失可染色的DNA物质。
[0013]因此，本领域中已经进行了尝试以基于形态特征鉴定、免疫组化染色和DNA染色的组合可靠地检测癌细胞并诊断癌症。
[0014]US 2004/0197839 Al公开了同时使用两种不同类型的染色以鉴别癌细胞，其中一种染色例如检测形态特征，而第二种(免疫学)染色例如测量一种肿瘤特异性标记的表达。
[0015]但是，仍然需要给出测量细胞核DNA的量并检测癌细胞和癌症的可靠、迅速及有效的途径的方法。
[0016]发明目的和简述
[0017]本发明的一个目的是提供用于确定细胞的细胞核内的核酸的量的方法。这些核酸可以是双链的，例如DNA。
[0018]本发明的另一个目的是提供检测待测生物样品中癌细胞的存在的方法。
[0019]本发明一个进一步的目的是提供使得能够诊断人或动物对象体内癌症的存在和/或癌症可能发生的方法。
[0020]为了实现上述目的，提供了独立权利要求中限定的方法。本发明一些优选的实施方案特别在从属权利要求中限定。
[0021]根据本发明的一个实施方案，提供了体外确定至少一个生物样品中存在的至少一个细胞中的细胞核核酸例如细胞核DNA的量的方法，其中所述方法包括如下步骤:
[0022]a)体外确定所述细胞内细胞核的位置和/或尺寸，
[0023]b)体外确定a)中确定的细胞核的边界内的UV吸收。
[0024]在一个示例性实施方案中，所述细胞核的位置和/或尺寸可以通过使用UV光和/或相差显微术在所述至少一个细胞中(粗略)确定。如果在步骤a)中使用UV光，应当优选地使用波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光。特别优选的是波长例如为大约250nm、255nm 或 260nmo
[0025]在另一个示例性实施方案中，使用波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光用于在步骤b)中测量UV吸收。特别优选的是波长例如为大约250nm、255nm或260nm。
[0026]在另一个实施方案中，可以将所述至少一个细胞与至少一种能够与所述至少一个细胞内的双链核酸相互作用的荧光标记接触，并从而通过步骤b)中的UV吸收确定结合至细胞核双链核酸的所述至少一种荧光标记的细胞核信号强度。为此目的，可以使用例如波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光。
[0027]然而，在本发明其他示例性实施方案中，不需要使所述细胞中的细胞核核酸例如DNA通过例如免疫组化染色、化学反应例如福尔根反应或荧光标记显色。
[0028]因此，本发明的方法包括实现确定细胞内细胞核的位置和/或尺寸并确定所述细胞核的边界内的UV吸收的基本概念的各种实施方案。为了确定细胞核位置和/或尺寸(等同于确定细胞核的边界)，可以使用利用可见光的相差显微术以及利用UV光的检测方法。为了确定细胞核的UV吸收，可以仅依赖于UV测量而不加入能够与双链核酸相互作用的荧光标记，或者可以使用这些标记。
[0029]因此，理论上可以用相差显微术对细胞核进行定位并确定所述细胞核的UV吸收而不使用上文描述的标记，也可以用相差显微术对细胞核进行定位并使用上文描述的标记确定所述细胞核的UV吸收，可以使用UV吸收测量以对细胞核进行定位并测量细胞核UV吸收而不使用上文描述的标记，以及可以使用UV吸收测量以对细胞核进行定位并使用上文描述的标记测量细胞核UV吸收，等等。
[0030]在两个示例性实施方案中，本发明涉及用相差显微术对细胞核进行定位并使用上文描述的标记确定UV吸收，或涉及使用UV吸收测量以对细胞核进行定位并测量细胞核UV吸收而不使用上文描述的标记。这两个实施方案将在下文进一步详细描述。然而，本领域技术人员清楚地了解，如果在这两个实施方案的范围内讨论某些方面例如优选的波长、标记的性质、使用的检测装置等等，那么这些解释等同地适用于如上文所述的本发明的其他实施方案，除非其另外明确地指出。术语例如“细胞”、“癌细胞”、“样品”、“非整倍性(aneuploidity) ”等等的定义在本发明的各个实施方案中当然具有同样的含义，除非另外指出。本发明设想的各种方法也可以用于同样目的。
[0031]在本发明一个示例性实施方案中，前述用于确定细胞内细胞核核酸例如DNA的量的方法可以用于体外检测至少一个生物样品内的至少一个癌细胞。
[0032]在上述方法的一个进一步的实施方案中，细胞核UV吸收(也可以称为细胞核信号强度)也可以用于计算细胞的(非整)倍性((aneu)ploidity)状态。
[0033]这可以通过将获得的细胞核UV吸收与在与已知为非癌类型并且细胞核DNA含量已知的细胞在基本上相仿或相同条件下获得的细胞核UV吸收对比实现。
[0034]在本发明另一个实施方案中，偏离2或4至少10%的非整倍性状态被认为提示癌细胞。
[0035]在本发明一个实施方案中，如上述确定细胞内细胞核核酸例如DNA的量的方法用于检测至少一个生物样品中的至少一个癌细胞，所述癌细胞与选自包括白血病、淋巴瘤、脑癌、脑脊液癌(cerebrospinal cancer)、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和黑素瘤的一组的癌症相关。
[0036]在本发明另一个实施方案中，如上述确定细胞内细胞核核酸例如DNA的量的方法在生物样品的至少一个细胞上进行，其中所述生物样品选自包括骨髓细胞、淋巴结细胞、粘膜样品、周围血样品、脑脊液样品、尿样品、渗出物样品、细针抽取物、周围血碎肩、皮肤碎肩、石蜡包埋组织和冷冻切片的一组。
[0037]在本发明另一个实施方案中，检测生物样品中具有上文描述的特征的癌细胞的方法使用能够检测、测量和计算UV吸收信号及任选地相差信号的显微镜。在一个优选的实施方案中，使用共聚焦激光扫描显微镜。
[0038]在所有上述方法中，可以依赖于具有预先确定的单一波长的(UV)光检测细胞核并测量细胞核UV吸收。
[0039]在本发明另一个实施方案中，提供了诊断和/或预测人或动物对象体内癌症的体外方法，所述方法包括如下步骤:
[0040]a)提供得自所述对象的生物样品；
[0041]b)体外确定所述样品的至少一个细胞内细胞核的位置和/或尺寸；
[0042]c)体外测量在a)中确定的细胞核的边界内的UV吸收；
[0043]d)从步骤d)中获得的细胞核信号强度计算所述至少一个细胞的倍性状态，和
[0044]e)基于所述倍性状态确定癌症的存在和/或可能未来发生癌症。
[0045]本发明的诊断方法也包括实现确定细胞内细胞核的位置和/或尺寸并确定所述细胞核的边界内的UV吸收的基本概念的各种实施方案。为了确定细胞核位置和/或尺寸(等同于确定细胞核的边界)，仍旧可以使用利用可见光的相差显微术以及利用UV光的检测方法。为了确定细胞核的UV吸收，可以仅依赖于UV测量而不加入能够与双链核酸相互作用的荧光标记，或者可以使用这些标记。
[0046]虽然诊断方法仍旧将主要针对两个示例性实施方案描述，即用相差显微术对细胞核进行定位并使用上文描述的标记确定细胞核的UV吸收，或使用UV吸收测量以对细胞核进行定位并测量细胞核UV吸收而不使用上文描述的标记，但是本领域技术人员了解，如果在这两个实施方案的范围内讨论某些方面例如优选的波长、标记的性质、使用的检测装置等等，那么这些解释等同地如上文所述应用于本发明的其他实施方案，除非其另外明确地指出。术语例如“细胞”、“癌细胞”、“样品”、“非整倍性(aneuploidity) ”等等的定义在本发明的各个实施方案中当然具有同样的含义，除非另外指出。
[0047]当然，上文描述的各个方面例如使用某些波长或某些类型的显微镜等等，等同地应用于诊断范围。
[0048]因此，在一个示例性实施方案中，细胞核的位置和/或尺寸可以通过使用UV光和/或相差显微术在所述至少一个细胞中(粗略)确定。如果在步骤b)中使用UV光，应当优选地使用波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光。特别优选的是波长例如为大约250nm、255nm 或 260nmo
[0049]在本发明另一个实施方案中，在步骤b)中细胞核在所述至少一个细胞中的位置和/或尺寸仅通过相差显微术确定。
[0050]在另一个示例性实施方案中，在步骤c)中使用波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光测量UV吸收。特别优选的是波长例如为大约250nm、255nm或260nm。
[0051]在另一个实施方案中，在步骤c)中可以将所述至少一个细胞与至少一种能够与所述至少一个细胞内的双链核酸相互作用的荧光标记接触，并从而确定结合至双链核酸的所述至少一种荧光标记的细胞核信号强度。为此目的，可以使用波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光。
[0052]在诊断方法的另一个示例性实施方案中，不需要使所述细胞中的细胞核核酸例如DNA通过例如免疫组化染色、化学反应例如福尔根反应或荧光标记显色。
[0053]如果使用荧光标记，那么可以将上文和下文描述的同样类型的标记与细胞接触。
[0054]本发明这一方面的另外一个实施方案涉及诊断和/或预测人或动物对象体内的癌症的体外方法，所述方法包括上述特征，并且其中偏离2n或4η(η是染色体数目)至少10%的倍性状态提示癌细胞，并因此提示癌症的存在或(未来)可能发生的癌症。
[0055]当然，对于本发明这些关于诊断方法的方面，所述生物样品可以选自与上文描述的相同的样品。
[0056]因此，用上文描述的诊断方法诊断的和/或预测的癌症可以选自与上文描述的相同的一组癌症。
[0057]在本发明另一个实施方案中，诊断和/或预测人或动物对象体内的癌症的方法使用能够检测UV吸收信号、荧光信号并且可任选地用于相差目的的显微镜。为了确定细胞核的位置和/或尺寸以及细胞核UV吸收，可以优选地使用共聚焦激光扫描显微镜。
【附图说明】
[0058]图1示出了一幅直方图，即当确定了一群非癌细胞的细胞核DNA含量后典型地获得的光密度模式。所述细胞处于非增殖状态。
[0059]图2示出了一幅直方图，即当确定了一群癌细胞的细胞核DNA含量后典型地获得的光密度模式。相应于值为4的峰提示正在进行的癌症发展，因为被检查的细胞类型在其正常状态是非增殖的。
[0060]图3示出了在眼中(左图)和口中(右图)的刷拭活检的实施例。
[0061]图4示出了在大约230nm和300nm波长范围之间DNA和蛋白质的不同吸收行为。
[0062]图5示出了本发明使用波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光确定细胞核的边界的一个实施方案的原则的示意图。
[0063]图6示出了粘膜细胞的荧光测量，所述细胞已经用EtBr染色。细胞核清晰可见，但是细胞其他部分也显示一些焚光。
[0064]图7示出了粘膜细胞的相差图像(左图)、荧光图像(中间图)和组合图像(右图)，所述细胞已经用EtBr染色。将所述相差显微术图像与荧光图像合并并相关使得可以精确地确定细胞核位置及其尺寸。
[0065]发明详述
[0066]通