[0219]在本发明的范围内，术语“非整倍性状态”涉及细胞内细胞核DNA的异常量。
[0220]为了获得可靠的结果，细胞核DNA的量和之后的推断的癌细胞的光密度图(直方图)优选地从一群细胞计算，并且优选地测量大约100至700个细胞，优选地大约100至300个细胞。
[0221]如果检查例如来自肝组织的癌细胞，将会例如获得具有两个主峰的光密度图，对应值为2和4。然而，除了非癌细胞的情况之外，所述两个主峰光密度图不会是尖且窄的，而是宽的。另外，会在所述光密度图中观察到低于2、高于2、低于4和高于4的峰和信号。图2不出了一个实例。
[0222]由于在任何实例中大多数细胞的DNA含量是2，偏离所述大多数也可以被认为是异常或可疑的。在癌样品的情况中(正常细胞是少数)，在DNA含量方面仍有可以用于将所述样品标记为可疑的大的差异。
[0223]因此如果基于根据本发明如上文描述的所获得的细胞核UV吸收计算的光密度图显示峰信号在相应于值为2 (和4，依赖于所述细胞在其正常状态中的增殖状态)的峰之外，可以将一个细胞评为癌性的。
[0224]然而，相应于值为2 (和4)的峰其本身可能也提示细胞的癌性可能，如果它们显示较宽的曲率的话。为了根据相应于值为2(和4)的峰型确定一幅光密度图是否确实提示癌症发展，可以将推断的癌细胞样品的光密度图与上文描述的标准或参考光密度图叠加。
[0225]在提示标准光密度图的值2和4的光密度图的峰的曲线下的区域(area underthe curve, AUC)被认为提示非癌细胞，并且任何偏离推断的癌细胞的光密度图的相应峰的AUC至少10%被认为提示癌细胞或状态。在一个优选的实施方案中，所述偏离至少是15%、至少是20%、至少是25%、至少是30%、至少是40%或至少是50%。
[0226]也可以应用在Haroske et.al."1997ESACP consensus report on diagnosticDNA image cytometry", Analytical Cellular Pathology 17(1998) 189-200 中列出的标准，其中解释了当细胞被认为是正常的或癌性的时的详细情况。
[0227]因此，可疑癌细胞(群)的细胞核UV吸收/细胞核信号强度与从相当的非癌细胞类型获得的细胞核UV吸收的对比提示正在进行的或未来可能的癌症发展。
[0228]为了本发明的目的，DNA含量的显著异常被认为提示癌症发展，如果可疑癌细胞的倍性状态偏离倍性值2(和4，如果所述细胞在其健康状态中是增殖的)至少10%的话。在一个优选的实施方案中，所述偏离至少是15%、至少是20%、至少是25%、至少是30%、至少是40%或，至少是50%。光密度图中的一个峰代表值为2或4，对于这个峰的与在参考光密度图中的相应峰相同的部分。
[0229]相应于已有实践，如果相应于参考光密度图的值为2的峰的峰范围为从1.8至2.2，可以将细胞的DNA含量称作近似二倍体(peridiploid)。
[0230]如果相应于参考光密度图的值为4的峰的峰范围为从3.6至4.4，可以将细胞的DNA含量称作近似四倍体(peritetraploid)。
[0231]在这些范围之外的值均被认为是X-倍体。
[0232]为了本发明的目的，具有近似二倍体、近似四倍体和X-倍体值的细胞和组织被认为是癌细胞。
[0233]因此，上文描述的方法可以用于通过将用本发明的方法对于推断的癌细胞获得的细胞核UV吸收与使用相同方法对于已知为非癌性的相当的细胞类型获得的细胞核UV吸收对比计算生物样品中的推断的癌细胞的倍性(非整倍性)状态。
[0234]为了本发明的目的，术语“非癌性的(non-canceixms)”是指已知不提示癌症发生的细胞。
[0235]在本发明的一个实施方案中，所述癌细胞可以与选自包括白血病、淋巴瘤、脑癌、脑脊液癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和黑素瘤的一组的癌症相关。
[0236]诊断方法
[0237]如上文所述，本发明也涉及诊断和/或预测人或动物对象体内癌症的体外方法，所述方法包括如下步骤:
[0238]a)提供得自人或动物对象的生物样品；
[0239]b)体外确定所述样品的至少一个细胞内细胞核的位置和/或尺寸；
[0240]c)体外测量在a)中确定的细胞核的边界内的UV吸收；
[0241]d)从步骤d)中获得的细胞核信号强度计算所述至少一个细胞的倍性状态，
[0242]e)基于所述倍性状态确定癌症的存在和/或可能未来发生癌症。
[0243]本发明的诊断方法也包括实现确定细胞内细胞核的位置和/或尺寸并确定所述细胞核的边界内的UV吸收的基本概念的各种实施方案。为了确定细胞核位置和/或尺寸(等同于确定细胞核的边界)，仍旧可以使用利用可见光的相差显微术以及利用UV光的检测方法。为了确定细胞核的UV吸收，可以仅依赖于UV测量而不加入能够与双链核酸相互作用的荧光标记，或者可以使用这些标记。
[0244]在下文中，将要讨论这些方法的一般方面。将要针对两个特别的实施方案讨论进一步的问题。本领域技术人员了解将要更详细地讨论的这两个实施方案的某些方面可以相似地应用于上文预料的其他实施方案。
[0245]对于步骤a)，生物样品可以使用常规方法例如刷拭活检、抽取、细针抽取活检、内窥镜活检等等从人或动物对象获得。
[0246]之后可以如上文描述的可以优选地应用于检测生物样品内至少一个癌细胞的体外确定细胞内细胞核双链核酸的量的方法的步骤a)和b)进行步骤b)、c)和d)。
[0247]在上文称为步骤e)的最后一步中，基于受检细胞的细胞核DNA含量或倍性状态确定癌症的存在或可能未来发生癌症。在介绍两个实施方案后这个最后一步将会更加详细地进行讨论。
[0248]当然，上文给出的关于确定针对推断的癌细胞的光密度图和参考或标准的光密度图的解释，术语例如“体外”、“大约”、“倍性”、“非整倍性”、“近似二倍体”、“近似四倍体”、“X-倍体”、“AUC”等等的含义等同地应用于本发明的诊断和/或预防癌症的方法的范围内。
[0249]术语“体外”是指上述诊断方法的所有步骤不直接接触所述人或动物体而进行。
[0250]实施方案1-诊断方法
[0251]在一个实施方案中，本发明涉及诊断和/或预测人或动物对象体内癌症的体外方法，所述方法包括如下步骤:
[0252]a)获取包含来自所述对象的至少一个细胞的生物样品；
[0253]b)体外确定所述细胞内细胞核的位置和/或尺寸；
[0254]c)使用UV光体外测量在b)中确定的细胞核的边界内的UV吸收；
[0255]d)从步骤c)中获得的细胞核UV吸收计算所述至少一个细胞的细胞核DNA含量或倍性状态，以及
[0256]e)基于所述细胞核DNA含量或倍性状态确定癌症的存在或可能未来发生癌症。
[0257]步骤b)和c)可以如上文描述的体外确定一个细胞内的细胞核双链核酸的量的实施方案I的步骤a)和b)进行，所述实施方案I可以优选地进行以检测生物样品中存在的至少一个癌细胞。
[0258]在本发明这些方面的一个优选的实施方案中，使用波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光在步骤a)和/或b)中测量UV吸收。特别优选的是波长例如为大约250nm、255nm 或 260nmo
[0259]步骤d)也可以如上文描述的进行。
[0260]在上文称为步骤e)的最后一步中，基于受检细胞的细胞核DNA含量或倍性状态确定癌症的存在或可能未来发生癌症。
[0261]在进行这个诊断和/或预测癌症的方法中，可以使用相同的用于分离生物样品、用于制备细胞样品、用于将涉及的细胞可能地与荧光标记接触、用于确定信号强度的方法。
[0262]因此，在一个优选的实施方案中，使用共聚焦激光扫描显微术鉴别细胞核的边界和测量细胞核UV吸收。为此目的，可以使用例如上文描述的仪器。
[0263]实施方案2-诊断方法
[0264]在另一个实施方案中，本发明涉及诊断和/或预测人或动物对象体内癌症的体外方法，所述方法包括如下步骤:
[0265]a)获取来自所述对象的生物样品；
[0266]b)将所述至少一个细胞与能够与所述至少一个细胞内的双链核酸在所述对象体外相互作用的至少一种荧光标记接触；
[0267]c)用通过用合适的光源激发获得的信号确定结合至双链核酸的所述至少一种荧光标记的信号强度；
[0268]d)通过相差显微术确定所述至少一个细胞内细胞核的位置和/或尺寸；
[0269]e)通过将c)中获得的信号强度与d)中获得的细胞核的位置和/或尺寸相关联而确定结合至细胞核双链核酸的荧光标记的细胞核信号强度。
[0270]f)从步骤e)中获得的细胞核信号强度计算所述至少一个细胞的细胞核DNA含量或倍性状态
[0271]g)基于所述细胞核DNA含量或倍性状态确定癌症的存在或可能未来发生癌症。
[0272]步骤b)至e)可以如上文描述的确定一个细胞内的细胞核双链核酸的量的实施方案2的步骤a)至d)进行，所述实施方案2可以优选地进行以检测生物样品中存在的至少一个癌细胞。
[0273]步骤f)也可以如上文描述的进行。
[0274]在上文称为步骤g)的最后一步中，基于受检细胞的细胞核DNA含量或倍性状态确定癌症的存在或可能未来发生癌症。
[0275]在进行这个诊断和/或预测癌症的方法中，可以使用相同的用于分离生物样品、用于制备细胞样品、用于将涉及的细胞与荧光标记接触、用于确定信号强度、用于如上文列出的进行相差显微术以进行确定细胞核内双链核酸的量的方法的方法。
[0276]因此，所述荧光标记可以是任何能够与双链核酸特异地相互作用并在用合适的光源激发后提供荧光信号的分子。
[0277]这些荧光标记可以例如结合至DNA大沟或小沟。它们可以是核酸碱基嵌入剂并选自包括4’，6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化吡啶(PI)和溴化乙锭(EtBr)的一组。荧光标记也包括SYBR green ο
[0278]本领域技术人员知道上文讨论的步骤顺序可以改变。因此可以通过首先将样品与荧光标记接触并温育开始、进行相差显微术以及之后确定荧光信号强度。在某些环境中，也可以例如首先进行相差显微术，之后将样品与荧光标记接触并温育，最后测量荧光信号强度。
[0279]在本发明的一个实施方案中，诊断和/或预测人或动物对象体内癌症的方法大体上依赖于前述步骤，步骤d)在步骤b)至c)之前，步骤c)之后进行步骤e)、f)和g)。
[0280]诊断方法-评估
[0281]在上述方法中，在最后一步e)中(或g)，在实施方案2的情况中)，断定癌症可能的未来发生的存在。
[0282]癌症诊断可以认为是阳性的，如果针对得自所述对象的生物样品的细胞确定的细胞核DNA含量或倍性值偏离相当的细胞类型的细胞核DNA含量或倍性值2 (和4，如果所述细胞在其健康状态中是增殖的)至少10%的话，其中所述相当的细胞类型的细胞核信号强度已经在高度相当的或相同条件下测量，并且其已知是非癌性的。在一个优选的实施方案中，所述偏离至少是15%、至少是20%、至少是25%、至少是30%、至少是40%或，至少是50%。
[0283]在提示标准光密度图的值2和4的峰的曲线下的区域(area under thecurve, AUC)被认为提示非癌细胞，并且任何偏离预测的癌细胞的光密度图的相应峰的AUC至少10%被认为提示癌细胞并因此导致阳性诊断。在一个优选地实施方案中，所述偏离至少是15%、至少是20%、至少是25%、至少是30%、至少是40%或至少是50%。
[0284]相应于已有实践，如果相应于参考光密度图的值为2的峰的峰范围为从1.8至2.2，可以将细胞的DNA含量称作近似二倍体(peridiploid)。
[0285]如果相应于参考光密度图的值为4的峰的峰范围为从3.6至4.4，可以将细胞的DNA含量称作近似四倍体(peritetraploid)。
[0286]在这些范围之外的值均被认为是X-倍体。
[0287]为了本发明的目的，具有近似二倍体、近似四倍体和X-倍体值的细胞被认为是癌细胞，并且相应地，如果DNA含量被认为是近似二倍体、近似四倍体或X-倍体，将会作出阳性癌症诊断。
[0288]所述诊断和/或预测癌症的体外方法可以用于诊断和/或预测选自包含白血病、淋巴瘤、脑癌、脑脊液癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和黑素瘤的一组的癌症。
[0289]所述诊断和/或预测癌症的方法可以用于分析选自包含骨髓细胞、淋巴结细胞、淋巴细胞、红细胞、神经细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、粘膜样品、周围血样品、脑脊液样品、尿样品、渗出物样品、细针抽取物、细针抽取活检、周围血碎肩、皮肤碎肩、脱落细胞涂片、来自体液的细胞离心制备物、细胞分离样品(在机械和/或酶分散之后)、石蜡包埋组织和冷冻切片的一组的样品。
[0290]在下文中，特别列出涉及上文描述的实施方案I或2的本发明的某些方面:
[0291 ] 实施方案1-某些方面
[0292]1.体外确定至少一个生物样品中存在的至少一个细胞中的细胞核核酸的量的方法，包括如下步骤:
[0293]a)体外确定所述细胞内细胞核的位置和/或尺寸，
[0294]b)使用UV体外测量a)中确定的细胞核的边界内的UV吸收。
[0295]2.根据I的方法，其中使用UV光和/或相差显微术确定所述至少一个细胞内细胞核的位置和/或尺寸。
[0296]3.根据I或2的方法，其中在步骤a)和/或b)中使用波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光。
[029