过DNA细胞术鉴别癌细胞典型地使用流式细胞术或成像细胞术进行。
[0067]在DNA成像细胞术(也可以称为ICM)的情况中，DNA用标记染色以使DNA显色。接下来，使用通常称为非整倍性的DNA量的改变或染色体结构畸变检测癌细胞的存在，因为非整倍性被认为是已经存在的癌性状态或正在发展的暂时性癌性状态的特征。因此，检测DNA非整倍性使得可以通过检测癌细胞进行癌症的早期及敏感诊断，通常在组织活检的形态学和组织学特征鉴定之前几年。
[0068]然而，如上文所述，已经确立的DNA生色反应例如福尔根染色方法非常耗力及耗时。
[0069]本发明人令人惊讶地发现体外确定细胞核DNA的量以及细胞的倍性状态不需要进行免疫组化染色或荧光标记或化学反应。
[0070]本发明人发现，一旦已经确定细胞内细胞核的位置和/或尺寸/边界，就可以仅依赖于UV光确定细胞核对UV的吸收。之后确定的UV吸收可用于计算细胞的细胞核DNA含量或倍性状态。这些发现特别适用于使用具有优选的波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光的情况。
[0071]本发明人进一步令人惊讶地发现在基于DNA成像细胞术的检测生物样品中癌细胞的方法中也可以使用能够与细胞内的双链核酸特异地相互作用的荧光标记。
[0072]因此，本发明在一个实施方案中涉及体外确定至少一个生物样品中存在的至少一个细胞中的细胞核核酸的量的方法，其中所述方法包括如下步骤:
[0073]a)体外确定所述细胞内细胞核的位置和/或尺寸，
[0074]b)体外测量a)中确定的细胞核的边界内的UV吸收。
[0075]如上文所述，基本上在步骤a)中可以使用任何可以确定细胞核的位置和/或尺寸以及边界的方法。这样的一个例子是相差显微术。然而，优选地在步骤a)中仅使用优选地波长在大约240nm和大约280nm之间的紫外(UV)光。步骤a)和b)中特别优选的波长大约为 250nm、255nm 或 260nm。
[0076]如果使用相差显微术，可以优选地通过将细胞与一个上文或下文所述的荧光标记接触确定细胞核UV吸收，即细胞核信号强度。
[0077]然而，在本发明其他示例性实施方案中，不需要通过将细胞与荧光标记接触而协助细胞核核酸显色。
[0078]这些方法可特别用于确定一个个体或物种的基因组大小。当然，这些方法也可用于检测至少一个生物样品中的至少一个癌细胞。将获得的细胞核UV吸收与已经用相同方法分析的非癌细胞的细胞核UV吸收对比可以实现此目的。
[0079]如上文所述，本发明的方法包括实现确定细胞内细胞核的位置和/或尺寸并确定所述细胞核的边界内的UV吸收的基本概念的各种实施方案。为了确定细胞核位置和/或尺寸(等同于确定细胞核的边界)，可以使用利用可见光的相差显微术以及利用UV光的检测方法。为了确定细胞核的UV吸收，可以仅依赖于UV测量而不加入能够与双链核酸相互作用的荧光标记，或者可以使用这些标记。
[0080]因此，原则上可以用相差显微术对细胞核进行定位并确定所述细胞核的UV吸收而不使用上文描述的标记，也可以用相差显微术对细胞核进行定位并使用上文描述的标记确定所述细胞核的UV吸收，可以使用UV吸收测量以对细胞核进行定位并测量细胞核UV吸收而不使用上文描述的标记，以及可以使用UV吸收测量以对细胞核进行定位并使用上文描述的标记测量细胞核UV吸收，等等。
[0081]在两个示例性实施方案中，本发明涉及用相差显微术对细胞核进行定位并使用上文描述的标记确定UV吸收，或涉及使用UV吸收测量以对细胞核进行定位并测量细胞核UV吸收而不使用上文描述的标记。这两个实施方案将在下文进一步详细描述。然而，本领域技术人员清楚地了解，如果在这两个实施方案的范围内讨论某些方面例如优选的波长、标记的性质、使用的检测装置等等，那么这些解释等同地如上文所述应用于本发明的其他实施方案，除非其另外明确地指出。术语例如“细胞”、“癌细胞”、“样品”、“非整倍性(aneuploidity) ”等等的定义在本发明的各个实施方案中当然具有同样的含义，除非另外指出。本发明设想的各种方法也可以用于同样目的。
[0082]在更详细地描述本发明的一些实施方案之前，介绍如下定义。
[0083]如在本说明书中和在后附权利要求书中所用，单数形式“一个”也包括相应的复数形式，除非上下文另外清晰地说明。因此，术语“一个微载体珠”可以包括多于一个微载体珠，即两个、三个、四个、五个等等微载体珠。
[0084]术语“大约”在本发明的范围内表示离精确值有一点距离，本领域技术人员了解所述距离仍旧保证所涉及的特征的技术效果。该术语典型地提示与所涉及的数字值偏差+/-10%，优选地+/-5 %。术语“大约”在关于波长的范围内涉及偏差1.5%，优选地1%，最优选地0.5%。
[0085]为了本发明的目的，术语“体外”是指细胞的分析，所述细胞已经从其天然环境分离并且在人或动物体外进行研宄。
[0086]为了本发明的目的，术语“癌细胞”涉及任何细胞、由细胞组成的细胞性组织或器官，这些细胞中的一些或全部含有与针对非癌细胞确定的细胞核DNA的量有偏差的量的细胞核DNA，这是染色体重复、缺失、插入、易位等等的结果。
[0087]已知染色体DNA的插入、重复、缺失和易位很大程度上导致癌症发展，并且因此被认为是癌细胞的特征。
[0088]为了本发明的目的，术语“生物样品”涉及任何含有细胞物质，优选人或动物对象的细胞的样品，所述样品需要测试在这些细胞中细胞核DNA的量，特别是测试癌细胞的存在。
[0089]这些生物样品因此可以选自包括骨髓细胞、淋巴结细胞、淋巴细胞、红细胞、神经细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、粘膜样品、周围血样品、脑脊液样品、尿样品、渗出物样品、细针抽取物、细针抽取活检、刷拭活检、周围血碎肩、皮肤碎肩、脱落细胞涂片、来自体液的细胞离心制备物、细胞分离样品(在机械和/或酶分散之后)、石蜡包埋组织和冷冻切片的一组。
[0090]术语“细胞核信号强度”典型地用于使用荧光标记的范围内，并且在下文进一步解释。本领域技术人员了解所述细胞核信号强度与细胞核UV吸收相关，假定所述信号强度通常越高，定位至细胞核的荧光标记吸收的UV光越多。
[0091]为了本发明的目的，术语“荧光标记”是指任何能够与双链核酸特异地相互作用并在用合适的光源激发后提供荧光信号的分子。一般地，本发明的荧光标记吸收波长在大约10nm(UV)至大约800nm之间的光。
[0092]这些荧光标记可以例如结合至DNA大沟或小沟。它们可以是核酸碱基嵌入剂并选自包括4’，6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化吡啶(PI)和溴化乙锭(EtBr)的一组。荧光标记也包括SYBR green ο
[0093]其他荧光剂包括SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、P0P-1、BOBO-UYOYO-U T0T0-1、J0J0-1、P0P0-2、L0L0-1、BOBO-1, Y0Y0-3, T0T0-3、PO-PRO-1, BO-PRO-1,TO-PRO-1、JO-PRO-1、P0-PR0-3、LO-PRO-1、B0-PR0-3、Y0-PR0-3、T0-PR0-3、T0-PR0-5、SYTO40 蓝色焚光核酸染色剂(blue-fluorescent nucleic acid stain)、SYTO 41 蓝色焚光核酸染色剂、SYTO 42蓝色荧光核酸染色剂、SYTO 43蓝色荧光核酸染色剂、SYTO 44蓝色荧光核酸染色剂、SYTO 45蓝色荧光核酸染色剂、SYTO 9绿色荧光核酸染色剂、SYTO 10绿色荧光核酸染色剂、SYTO 11绿色荧光核酸染色剂、SYTO 12绿色荧光核酸染色剂、SYTO 13绿色荧光核酸染色剂、SYTO 14绿色荧光核酸染色剂、SYTO 15绿色荧光核酸染色剂、SYTO 16绿色荧光核酸染色剂、SYTO 20绿色荧光核酸染色剂、SYTO 21绿色荧光核酸染色剂、SYTO 22绿色荧光核酸染色剂、SYTO 23绿色荧光核酸染色剂、SYTO 24绿色荧光核酸染色剂、SYTO25绿色荧光核酸染色剂、SYT026绿色荧光核酸染色剂、SYTO 27绿色荧光核酸染色剂、SYTOBC绿色荧光核酸染色剂、SYTO 80橙色荧光核酸染色剂、SYTO 81橙色荧光核酸染色剂、SYTO 82橙色荧光核酸染色剂、SYTO 83橙色荧光核酸染色剂、SYT084橙色荧光核酸染色剂、SYTO 85橙色荧光核酸染色剂、SYTO 86橙色荧光核酸染色剂、SYTO 17红色荧光核酸染色剂、SYTO 59红色荧光核酸染色剂、SYTO 61红色荧光核酸染色剂、SYTO 17红色荧光核酸染色剂、SYT062红色荧光核酸染色剂、SYTO 63红色荧光核酸染色剂、SYTO 64红色荧光核酸染色剂、B丫啶同源二聚体、B丫啶橙、7-AAD (7-氨基-放线菌素D)、放线菌素D、ACMA、DAP1、二氢乙锭、溴化乙锭、乙锭同源二聚体-1 (EthD-1)、乙锭同源二聚体-2 (EthD-2)、Ethidiummonoazide、Hexidium 1dide、Hoechst 33258 (bis-benzimide)、Hoechst 33342、Hoechst34580、Hydroxystibamidine、LDS 751或核黄。所有这些化合物可以购自例如InvitrogenGmbH, Germany。
[0094]为了本发明的目的，术语“与双链核酸相互作用”是指所述至少一种荧光标记与具有双链构象的核酸相互作用的能力。
[0095]在一个优选的实施方案中所述荧光标记可以与双链核酸特异地相互作用。在此范围内，术语“与双链核酸特异地相互作用”是指所述至少一种荧光标记优先地与具有双链构象的核酸相互作用的能力。
[0096]优先结合是指所述荧光标记在相同条件下与双链核酸相互作用，但是不与单链核酸相互作用，或至少以较低程度相互作用的能力。
[0097]荧光标记是否优先与双链核酸反应而不与单链核酸反应可通过体外实验确定，在所述实验中将固定化的分离的双链核酸和固定化的分离的单链核酸在相同条件下平行接触并在室温温育。之后，使用漂洗缓冲液。对于双链核酸，如果在用合适的光源激发之后发射上述波长，观察到比单链核酸更强的信号，那么该荧光标记被认为是特异于双链核酸的。
[0098]在另一个实施方案中，荧光标记可以不是如上述特异于双链核酸，但是具有当结合至核酸时发射出与其不结合时相比更强的荧光信号的能力。
[0099]例如在溴化乙锭的情况中，当结合至双链核酸时荧光信号增加?20倍，当结合至单链核酸时增加?10倍。对于SYBR green I，当结合至双链DNA时荧光信号增加?200倍。因此具有特异于双链核酸的标记并不是绝对必需的，因为根据本发明，在细胞核和细胞质染色之间进行区别将在下文进行解释。如果使用当结合至DNA时得到更强的信号的标记，则有可能避免漂洗，这将在下文进行解释。
[0100]当然，在一个优选的实施方案中，可以使用与双链核酸特异地相互作用并具有在结合状态相对于未结合状态下发射出更强信号的能力的标记例如溴化乙锭。
[0101]在确定细胞的细胞核的位置和/或尺寸，即边界之前，并且也在将所述至少一个生物样品中的至少一个(推断的癌)细胞与所述至少一个能够与双链核酸特异地相互作用的荧光标记接触之前，对于本发明的一些实施方案可能需要和/或建议制备所述生物样品，例如制备所述至少一个(推断的癌)细胞用于测量UV吸收。
[0102]制备用于在DNA成像细胞术中测试生物样品中的细胞的生物样品是本领域技术人员熟知的，并且可以包括稀释所述样品、通过荧光激活细胞分选(FACS)分离均一细胞群、使用免疫富集或传统细胞生物学和生化技术包括酶水解、机械或渗透破裂、(密度)离心、色谱、缓冲液透析等等富集并纯化某些细胞类型例如骨髓细胞、淋巴结细胞、淋巴细胞、红细胞、肝细胞、肾细胞、神经细胞、成纤维细胞、角质形成细胞等等。
[0103]如果需要，固定化(immobilized)在固体基质上的细胞样品可以被固定(fixed)。在这方面，本领域技术人员会考虑典型的固定辅助手段或辅助物例如干燥、甲醛、多聚甲醛、乙醇、丙醇、甲醇-丙酮、甲醇-冰乙酸、甲醇-福尔马林-冰乙酸等等。
[0104]尽管在一些情况下固定可能是有用的，但是其并不总是必需的。如果用整体设备检查样品，可能会建议不固定细胞，而是仅固定化它们。
[0105]但是，如果考虑固定，可以根据标准方案进行，包括例如如下步骤:
[0106]在多聚甲醛的情况中:
[0107].向细胞添加PBS配制的4 % PF溶液
[0108]?在室温温育5-30分钟
[0109]?用 PBS 漂洗
[0110]在甲醇/丙酮的情况中:
[0111]?将带有细胞的基质放入冰冷的100%甲醇中
[0112]?在-20°C 温育 5-30 分钟
[0113]?用100%丙酮漂洗带有细胞的基质
[0114]?使丙酮挥发。
[0115]可用于上文描述的行为(即分离和制备样品、分离和制备细胞、固定化、渗透和固定细胞)的方案可以例如取自荧光显微术方面的标准细胞生物学教科书和实验室手册，例如 Cell B1logy:A laboratory handbook, Volumes 1-1II, Cellis, J.E.ed.(1994)、Ausubel et al, Current Protocols in Molecular B1logy, Volumes 1-1II, Ausubel, R.M.ed.(1994)等等。
[0116]之后可以进行步骤a)以使用例如波长优选地在大约240nm和大约280nm之间的紫外(UV)光或例如使用相差显微术确定所述细胞内细胞核的位置和/或尺寸。
[0117]在下文中，将会更加详细地讨论本发明的两个示例性实施方案。在第一个实施方案中(下文中称为实施方案I)，使用具有优选的波长的UV光并且优选地不包括相差显微术和/或荧光标记的使用进行细胞核的定位和