7]4.根据3的方法，其中在步骤a)和/或b)中使用波长为大约250nm、255nm或260nm 的 UV 光。
[0298]5.根据I至4任一项的方法，其中所述细胞核核酸未用免疫组化染色、化学反应或焚光标记显色。
[0299]6.根据I至5任一项的方法，其中所述方法用于检测所述至少一个生物样品中的至少一个推断的癌细胞的方法。
[0300]7.根据I至6任一项的方法，其中所述至少一个细胞与选自包括白血病、淋巴瘤、脑癌、脑脊液癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和黑素瘤的一组的癌症相关。
[0301]8.根据6的方法，其中步骤b)中的细胞核UV吸收通过将步骤b)中获得的细胞核UV吸收与也使用权利要求1的步骤a)和b)分析的至少一个非癌细胞的细胞核UV吸收对比而用于计算推断的癌细胞的细胞核DNA含量或细胞的倍性状态。
[0302]9.根据8的方法，其中倍性状态或细胞核DNA含量偏离2至少10%提示癌细胞。
[0303]10.根据8的方法，其中倍性状态或细胞核DNA含量为1.8至2.2提示近似二倍体状态，倍性状态或细胞核DNA含量为3.6至4.4提示近似四倍体状态，倍性状态或细胞核DNA含量在这些范围之外提示X-倍体状态。
[0304]实施方案2-某些方面
[0305]1.确定至少一个生物样品中存在的至少一个细胞中的细胞核双链核酸的量的方法，包括如下步骤:
[0306]a)将所述至少一个细胞与至少一种能够与所述至少一个细胞内的双链核酸相互作用的荧光标记接触；
[0307]b)用通过用合适的光源激发所获得的信号确定结合至双链核酸的所述至少一种焚光标记的信号强度；
[0308]c)通过相差显微术确定所述至少一个细胞内细胞核的位置和/或尺寸；
[0309]d)通过将b)中获得的信号强度与c)中获得的细胞核的位置和/或尺寸相关联而确定结合至双链核酸的荧光标记的细胞核信号强度。
[0310]2.根据I的方法，其中所述方法用于检测所述至少一个生物样品中的至少一个推断的癌细胞。
[0311]3.根据2的方法，其中步骤d)中的细胞核信号强度通过将步骤d)中获得的信号强度与也使用权利要求1的步骤a)至d)获得的非癌细胞的细胞核信号强度对比而用于计算细胞的细胞核DNA含量或倍性状态。
[0312]4.根据I的方法，其中倍性状态或细胞核DNA含量偏离2或4至少10 %提示癌细胞。
[0313]5.根据4的方法，其中倍性状态或细胞核DNA含量为1.8至2.2提示近似二倍体状态，倍性状态或细胞核DNA含量为3.6至4.4提示近似四倍体状态，倍性状态或细胞核DNA含量在这些范围之外提示X-倍体状态。
[0314]6.根据2的方法，其中所述至少一个癌细胞与选自包括白血病、淋巴瘤、脑癌、脑脊液癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和黑素瘤的一组的癌症相关。
[0315]7.根据I的方法，其中所述生物样品选自包括骨髓细胞、淋巴结细胞、粘膜样品、周围血样品、脑脊液样品、尿液、渗出物、细针抽取物、周围血碎肩、皮肤碎肩、石蜡包埋组织和冷冻切片的一组。
[0316]8.根据I的方法，其中所述荧光标记选自包括结合至DNA大沟或小沟的物质、4’，6- 二脒-2-苯基吲哚(DAPI)、碘化吡啶(PI)和溴化乙锭(EtBr)、SYBR green、SYTOXBlue、SYTOX Green、SYTOX Orange、P0P-1、BOBO-1, YOYO-U TOTO-U JOJO-U P0P0-2、LOLO-1、BOBO-1、Y0Y0-3, T0T0-3、PO-PRO-1, BO-PRO-1, TO-PRO-1, JO-PRO-1, P0-PR0-3、LO-PRO-1、B0-PR0-3、Y0-PR0-3、T0-PR0-3、T0-PR0-5、SYTO 40 蓝色荧光核酸染色剂、SYTO41蓝色荧光核酸染色剂、SYTO 42蓝色荧光核酸染色剂、SYTO 43蓝色荧光核酸染色剂、SYTO 44蓝色荧光核酸染色剂、SYTO 45蓝色荧光核酸染色剂、SYTO 9绿色荧光核酸染色剂、SYTO 10绿色荧光核酸染色剂、SYTO 11绿色荧光核酸染色剂、SYTO 12绿色荧光核酸染色剂、SYTO 13绿色荧光核酸染色剂、SYTO 14绿色荧光核酸染色剂、SYTO 15绿色荧光核酸染色剂、SYTO 16绿色荧光核酸染色剂、SYTO 20绿色荧光核酸染色剂、SYTO 21绿色荧光核酸染色剂、SYTO 22绿色荧光核酸染色剂、SYTO 23绿色荧光核酸染色剂、SYTO 24绿色荧光核酸染色剂、SYT025绿色荧光核酸染色剂、SYTO 26绿色荧光核酸染色剂、SYTO 27绿色荧光核酸染色剂、SYTO BC绿色荧光核酸染色剂、SYTO 80橙色荧光核酸染色剂、SYTO 81橙色荧光核酸染色剂、SYTO 82橙色荧光核酸染色剂、SYT083橙色荧光核酸染色剂、SYTO 84橙色荧光核酸染色剂、SYTO 85橙色荧光核酸染色剂、SYTO 86橙色荧光核酸染色剂、SYTO17红色荧光核酸染色剂、SYTO 59红色荧光核酸染色剂、SYTO 61红色荧光核酸染色剂、SYTO17红色荧光核酸染色剂、SYTO 62红色荧光核酸染色剂、SYTO 63红色荧光核酸染色剂、SYTO 64红色荧光核酸染色剂、卩丫啶同源二聚体、卩丫啶橙、7-AAD (7-氨基-放线菌素D)、放线菌素D、ACMA, DAP1、二氢乙锭、溴化乙锭、乙锭同源二聚体-1 (EthD-1)、乙锭同源二聚体-2(EthD-2)、Ethidium monoazide、Hexidium 1dide、Hoechst 33258(bis-benzimide)、Hoechst 33342、Hoechst 34580、Hydroxystibamidine、LDS 751 和核黄的一组。
[0317]9.根据I的方法，其中荧光标记溴化乙锭用于检测生物刷拭活检样品中的与口腔上皮癌相关的癌细胞。
[0318]10.诊断和/或预测人或动物对象体内癌症的方法，包括如下步骤:
[0319]a)获取来自所述对象的生物样品；
[0320]b)将所述至少一个细胞与能够与所述至少一个细胞内的双链核酸在所述对象体外相互作用的至少一种荧光标记接触；
[0321]c)用通过用合适的光源激发获得的信号确定结合至双链核酸的所述至少一种荧光标记的信号强度；
[0322]d)通过相差显微术确定所述至少一个细胞内细胞核的位置和/或尺寸；
[0323]e)通过将c)中获得的信号强度与d)中获得的细胞核的位置和/或尺寸相关联而确定结合至细胞核双链核酸的荧光标记的细胞核信号强度。
[0324]f)从步骤e)中获得的细胞核信号强度计算所述至少一个细胞的倍性状态
[0325]g)基于所述倍性状态确定癌症的存在或可能未来发生癌症。
[0326]在下文中，本发明根据某些实验实施例进行说明。但是这些实施例不意味着将本发明限制为其范围，而是为了通过一些示例性实施方案说明本发明。
[0327]实验
[0328]实验1-在半固定的细胞上进行DNA成像细胞术测定
[0329]第一步中，可以例如通过刷拭活检取样(参见图3)。
[0330]第二步中，从取样刷上通过用例如生理缓冲液例如PBS pH7.4淋洗取样单元洗脱细胞。
[0331]第三步中，可以通过添加温和去污剂例如Triton X_100使所述细胞具有通透性而用于染色。为此目的，可以例如使用含有PBS pH 7.4,0.05% (w/v)Triton X-100的缓冲液。在(半)固定细胞方法的情况中，可以将细胞悬液加至显微镜载玻片上，之后干燥以进行固定化。
[0332]在下一步中，可以例如通过用发射波长从300至600nm的LEICA EL6000光源照亮显微镜玻片进行荧光测量。可以例如使用450nm光源。
[0333]通过全面扫描细胞，可以确定细胞核的位置。
[0334]之后可以使用Qimaging Retiga 2000R FASTCooled Mono 12-bit 照相机单元(www.qimaging.com)记录细胞核UV吸收。
[0335]如果这个细胞核UV吸收与在相同条件下针对已知为非癌的细胞获得的DNA含量相当，那么可以计算受检细胞的倍性状态并确定所述细胞是否可能发展为癌症。
[0336]实验2-在半固定的细胞上进行DNA成像细胞术测定
[0337]第一步中，可以例如通过刷拭活检取样(参见图3)。
[0338]第二步中，从取样刷上通过用例如生理缓冲液例如PHS pH7.4淋洗取样单元洗脱细胞。
[0339]第三步中，可以通过添加温和去污剂例如Triton X-100使所述细胞具有通透性而用于染色。为此目的，可以例如使用含有PBS pH 7.4,0.05% (w/v)Triton X-100的缓冲液。在(半)固定细胞方法的情况中，可以将细胞悬液加至显微镜载玻片上，之后干燥以进行固定化。
[0340]之后可以通过添加荧光嵌入染料例如溴化乙锭对细胞DNA进行染色。由于这种以及许多其他荧光染料当结合至DNA时具有强得多的荧光，因此可以不需要洗脱游离染料。然而，如果使得提高信号/背景比例，也可以进行漂洗。
[0341]在下一步中，可以例如通过用发射波长从300至600nm的LEICA EL6000光源照亮显微镜玻片进行荧光测量。可以例如使用488nm光源。(参见图6)
[0342]之后可以使用Qimaging Retiga 2000R FASTCooled Mono 12-bit 照相机单元(www.qimaging.com)记录发射的焚光信号。
[0343]在另一步中，同样的样品在相差显微术下记录，以鉴别所述细胞核的位置和/或尺寸(参见图7)。
[0344]在进一步的步骤中，合并通过荧光和相差显微术获得的图像，从而只有来自于细胞核的荧光信号被记录下来(参见图7)。
[0345]如果这个信号与在相同条件下针对已知为非癌的细胞获得的DNA含量相当，那么可以计算受检细胞的倍性状态并确定所述细胞是否可能发展为癌症。
【主权项】
1.体外确定至少一个生物样品中存在的至少一个细胞中的细胞核核酸的量的方法，包括如下步骤: a)体外确定所述细胞内细胞核的位置和/或尺寸， b)体外测量a)中确定的细胞核的边界内的UV吸收。
2.权利要求1的方法，其中使用UV光和/或相差显微术确定所述至少一个细胞内细胞核的位置和/或尺寸。
3.权利要求1或2的方法，其中在步骤a)和/或b)中使用波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光。
4.权利要求3的方法，其中在步骤a)和/或b)中使用波长为大约250nm、255nm或260nm 的 UV 光。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述至少一个细胞与能够与所述至少一个细胞内的双链核酸相互作用的至少一种荧光标记接触，并且其中用通过用合适的光源激发所获得的信号确定结合至双链核酸的所述至少一种荧光标记的细胞核信号强度。
6.权利要求1至4任一项的方法，其中所述细胞核核酸未用免疫组化染色、化学反应或焚光标记显色。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中所述方法用于检测所述至少一个生物样品中的至少一个推断的癌细胞的方法。
8.权利要求7的方法，其中所述至少一个癌细胞与选自包括白血病、淋巴瘤、脑癌、脑脊液癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、口腔及喉癌、食管癌、肺癌、结直肠癌、胰腺癌和黑素瘤的一组的癌症相关。
9.权利要求7的方法，其中通过将步骤b)中获得的细胞核UV吸收与也使用权利要求1的步骤a)和b)分析的至少一个非癌细胞的细胞核UV吸收进行对比，从而使用步骤b)中的细胞核UV吸收计算推断的癌细胞的细胞核DNA含量或倍性状态。
10.权利要求9的方法，其中倍性状态或细胞核DNA含量偏离数值2至少10%提示癌细胞。
11.权利要求9的方法，其中倍性状态或细胞核DNA含量为1.8至2.2提示近似二倍体状态，倍性状态或细胞核DNA含量为3.6至4.4提示近似四倍体状态，倍性状态或细胞核DNA含量在这些范围之外提示X-倍体状态。
12.诊断和/或预测人或动物对象体内癌症的方法，所述方法包括如下步骤: a)提供包含来自人或动物对象的至少一个细胞的生物样品； b)体外确定所述细胞内细胞核的位置和/或尺寸； c)体外确定在b)中确定的细胞核的边界内的UV吸收； d)从步骤c)中获得的细胞核UV吸收计算所述至少一个细胞的细胞核DNA含量或倍性状态，以及 e)基于所述细胞核DNA含量或倍性状态确定癌症的存在或可能未来发生癌症。
【专利摘要】本发明涉及使用UV光进行UV吸收测定在体外确定人或动物细胞内细胞核DNA的量的方法。本发明还涉及用于基于上述原则体外检测生物样品中的癌细胞的方法。本发明也涉及诊断或预测人或动物对象体内癌症的可能发生的体外方法。
【IPC分类】G06T7-40, G06T7-00, G01N33-50, G01N33-574, G01N21-33, G01N33-53, G01N33-58, C12Q1-68, G01N15-14
【公开号】CN104849228
【申请号】CN201510127627
【发明人】B·H·W·亨德里克斯, E·R·福森纳尔, G·斯佩克维尔斯, N·C·范德瓦尔特, S·凯珀
【申请人】皇家飞利浦电子股份有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2007年5月14日
【公告号】EP2038651A2, US9057729, US20090197272, WO2008001235A2, WO2008001235A3