细胞核UV吸收的确定。在第二个实施方案中(下文中称为实施方案2)，使用相差显微术和荧光标记进行细胞核的定位和细胞核UV吸收的确定。本领域技术人员了解这两个实施方案的某些方面(将进行更详细的讨论)例如在使用荧光标记的情况中的温育和漂洗步骤、检测设备和UV波长范围可以相似地应用至上文设想的其他实施方案中。在描述了所述两个实施方案的一些内容后，将要讨论可以如何使用细胞核UV吸收/细胞核信号强度确定细胞的倍性状态以及的癌发生性质的存在和/或可能的发生。
[0118]实施方案1-确定核酸的量
[0119]如上文所述，在一个实施方案中，本发明涉及体外确定至少一个生物样品中存在的至少一个细胞中的细胞核核酸的量的方法，其中所述方法包括如下步骤:
[0120]a)体外确定所述细胞内细胞核的位置和/或尺寸，
[0121]b)使用优选的波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光体外确定a)中确定的细胞核的边界内的UV吸收。
[0122]然而，在一个优选的实施方案中，使用优选的波长在大约240nm和大约280nm之间的紫外(UV)光。步骤a)和b)中特别优选的波长大约为250nm、255nm或260nm。
[0123]现在针对单一步骤a)至b)更详细地描述上文说明的确定细胞核核酸的量的方法(优选地用于检测至少一个生物样品中存在的至少一个癌细胞)。
[0124]一旦如上文描述的制备了细胞，之后可以进行步骤a)以使用波长优选地在大约240nm和大约280nm之间的紫外(UV)光确定所述细胞内细胞核的位置和/或尺寸。
[0125]DNA对波长在230至290nm之间的UV光以与蛋白质不同的效率吸收。在图4中，蛋白质和DNA在这段波长范围内的吸收作为波长的函数作图。从这幅图可以清楚地看到当使用波长在大约240nm和大约280nm之间例如250nm的UV光时，DNA比蛋白质吸收多得多的光(大约多50倍)。
[0126]这种行为可以用于确定细胞核的边界，即位置和/或尺寸。
[0127]可以例如使用发射大约240nm和大约280nm之间的光的光点并用此光点在一个细胞的一个平面内扫描所述细胞。这可以例如使用共聚焦激光扫描显微镜实现。由于细胞核几乎包含细胞的全部DNA，并且由于细胞质相当程度地由蛋白质组成，因此当所述光点从细胞质透射至细胞核时，将会观察到吸收急剧增加。因此如果用这种光点扫描细胞的一个平面截面，可以通过测量吸收的改变清楚地鉴别所述细胞核的边界。
[0128]为了本发明的目的，可以使用波长优选地在大约240nm和大约280nm之间的UV光确定细胞内细胞核的边界。在本发明进一步优选的实施方案中，所述波长是大约250nm、255nm 或 260nmo
[0129]使用共聚焦显微镜装置，可以将在所述细胞的细胞核内的探测聚焦。典型地使共聚焦装置的探测点(probe spot)小于细胞核。
[0130]使用此方法，可以不仅在单一框架内定位细胞核的位置，还可以实际上确定细胞核的整体尺寸即其体积。
[0131]这可以如下进行。通过如上描述在一个单一平面内扫描光点，可以确定如上描述的确定反射光的强度。在移动方向上的距离(在此距离内信号相对较低)测量细胞核的局部厚度。
[0132]如图5所示，对于细胞核的单一平面内的单一扫描，这些1-D扫描可以扩展至3维，以通过对不同平面进行同样的测量获得细胞核的完整形状。在不同坐标(xy)，细胞核的局部厚度在z方向测量。因此，通过来自各个平面的不同1-D图像重建3-D图像，可以重建并计算细胞核的表观和体积。
[0133]从细胞核反射回来的UV光的量(如通过共聚焦装置测量的)反比于被所述光点探测的区域吸收的光的量。假设此吸收在整个细胞核都几乎相等，那么可以优选地校准所述测量并确定细胞核核酸的UV吸收。
[0134]校准由确定在所述共聚焦扫描的同一平面内细胞核和细胞核外的区域对UV光的吸收组成。对于细胞核内和外的测量，光线在到达感兴趣的细胞之前几乎穿透相同量和距离的组织，在两次测量中产生相当的和相似的背景信号。因此，细胞核吸收vs.非细胞核吸收的测量值之间的比例可以作为细胞核吸收的绝对测量值。但是，如果分析单层细胞，可能并不总是需要校准信号。
[0135]在本发明的优选的实施方案中，使用波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光。在一个特别优选的实施方案中，使用波长为大约250nm、255nm或260nm的UV光。
[0136]使用UV光，特别是波长在240nm和280nm之间的UV光的原因仍然是细胞核中的DNA在这一波长范围内显示比蛋白质高得多的吸收(参见图4)。
[0137]因此既含有蛋白质也含有DNA的细胞核比细胞的剩余部分(主要含有蛋白质而几乎没有DNA)吸收更多的光。
[0138]优选地使用共聚焦激光扫描显微镜，可以测量细胞核内的物质反射的UV光，并将其与细胞核外的细胞物质反射的进行对比。通过计算被细胞核吸收的UV光与被细胞核外的区域吸收的UV光的比值，可以获得一个信号，其是用共聚焦扫描获得的单一平面内的DNA密度的测量值。
[0139]因此，根据本发明，特别通过校准细胞核内的UV吸收信号可以获得细胞核UV吸收的测量值。如果仅比较同一平面的信号的话，这个单一平面的(校准的)信号可以当作UV吸收的测量值。然而，也可以将用于确定细胞核的体积的各个平面的(校准的)信号(见上文)相加，获得对整个细胞的UV吸收的测量。
[0140]所有这些优选地通过使用共聚焦激光扫描显微术实现，其中使用波长在大约240nm和大约280nm之间的UV光。在一个特别优选的实施方案中，使用波长为大约250nm、255nm 或 260nm 的 UV 光。
[0141]本领域技术人员当然熟知记录UV吸收信号以及使用这些信号计算例如细胞核的图像的方法。
[0142]确定信号强度，即吸收的或透射的光的量，可以使用典型地用于这些目的的仪器进行。
[0143]为了检测所述信号，可以使用能够检测UV吸收信号的显微镜。在本发明一个优选的实施方案中，同样的显微镜可以提供所需要的设备以在相差中也观察待检细胞。一种可以优选地用于检测UV吸收信号的显微镜类型可以是共聚焦激光扫描显微镜。
[0144]共聚焦显微术具有优于传统光学显微术的一些优点，最重要的优点之一是消除扭曲图像的焦点外信息、可控景深和亚微米分辨率。共聚焦显微术的一个进一步的优点是可以过滤掉样品的各个部分的焦点外荧光，从而不干扰焦点内的部分或截面，从而产生比通过传统光学显微术获得的相当的图像明显更为清晰，并且显示更好的分辨率的图像。
[0145]共聚焦扫描显微术的基础原理是使用了在与物镜被聚焦的点“共轭”的显微镜透镜系统的焦点具有小孔的屏幕。只有来自物镜焦点的光被聚焦在所述小孔并可以通过，到达检测器，例如可以是电荷耦合装置(CCD)。来自样品的焦点外截面的光被几乎全部过滤掉。
[0146]因此，对于X-和y-方向，共聚焦显微镜具有比传统显微镜显著更好的分辨率。另夕卜，其在Z-方向具有更小的景深。通过扫描穿过样品的焦点，可以观察样品的不同平面，并从而重建样品的3维图像。进一步地，共聚焦显微术与不同波长的光都相容。
[0147]对于对细胞核进行定位，共聚焦扫描显微镜可以使用单色光或复色光；然而，波长在240nm和280nm之间的单色UV光可能是优选的。特别优选的可能是波长为250nm、255nm或260nm的UV光。
[0148]对于共聚焦激光扫描显微镜，可以使用例如LEICA DMLM并具有Qimaging Retiga2000R FASTCooled Mono 12-bit照相机单元(www.qimaging.com)的显微镜用于测量焚光信号的信号强度。
[0149]信号强度(即被吸收的或透射的光的量)的确定通过使用典型地用于这些目的的仪器进行。
[0150]因此，可以例如使用连接至当用上述光源激发时用于观察细胞的显微镜光圈的电荷耦合装置或数码照相机。当然也可以使用胶卷等等。
[0151]检测单元可以例如是通过BQ6000图像采集板(frame-grabber board)连接至计算机的Optronics DE1-700CE three-chip CCD照相机。或者可以使用HitachiHV-C20three-chip CO)照相机。用于图像分析的软件包可以例如是B1quant TrueColor Windows 98v3.50.6 图像分析软件包(R&M B1metrics, Nashville, TN)或Image-Pro Plus 3.0图像分析软件包。可以使用的另一个系统是B1 ViewDuet系统(B1 View Ltd, Rehovot, Israel)，所述系统基于双模、全自动显微镜(Ax1plan 2, Carl Zeiss, Jena, Germany)、XY 驱动的 8_ 载片平台(8-slides stage)(Marzhauser, ffetzler, Germany)、3CCD顺序扫描彩色照相机(DXC9000, Sony, Tokyo, Japan)和用于控制和分析系统和数据的计算机。
[0152]本发明的一个优点是细胞核的边界的确定和细胞核UV吸收的测量通过同样的仪器进行，例如共聚焦激光扫描显微镜。
[0153]另一个优点是本发明不需要使细胞核DNA用例如荧光标记(尽管可以使用)、化学反应或免疫组化染色显色，因为优选的UV波长240nm至280nm及特别地250nm、255nm和/或260nm足以可靠地鉴别细胞核和可用于计算存在的细胞核DNA的量的UV吸收值。
[0154]实施方案2-确定核酸的量
[0155]如上文所述，在一个实施方案中，本发明涉及体外确定至少一个生物样品中存在的至少一个细胞中的细胞核核酸的量的方法，其中所述方法包括如下步骤:
[0156]a)将所述至少一个细胞与至少一种能够与所述至少一个细胞内的双链核酸相互作用的荧光标记接触；
[0157]b)用通过用合适的光源激发所获得的信号确定结合至双链核酸的所述至少一种焚光标记的信号强度；
[0158]c)通过相差显微术确定所述至少一个细胞内细胞核的位置和/或尺寸；
[0159]d)通过将b)中获得的信号强度与c)中获得的细胞核的位置和/或尺寸相关联而确定结合至双链核酸的荧光标记的细胞核信号强度。
[0160]在本发明另一个实施方案中，步骤c)可以在步骤a)之前进行，步骤d)可以在步骤b)之后进行。
[0161]一旦已经以合适的方式制备了包括所述至少一个待检生物样品的所述至少一个(推断的癌)细胞的细胞，可以将被固定化的并且任选地被渗透并且固定的细胞与能够与细胞内的双链核酸特异地相互作用的至少一种荧光标记接触。
[0162]为此目的，所述至少一种荧光标记可以配制进合适的温育缓冲液。原则上可以使用任何中性pH的等渗缓冲液。
[0163]可以将细胞样品与这种含有荧光标记的溶液在至少4°C一起温育至少10秒。典型地，并且在一些情况中优选地，温育在室温(例如20-25? )进行至少几分钟。
[0164]一旦将得自所述至少一个生物样品的细胞样品的至少一个(推断的癌)细胞与能够与双链核酸特异地相互作用的至少一种荧光标记接触，可以在上文中称为步骤b)的第二步骤中确定通过用合适的光源激发获得的特异地结合至温育的细胞内的双链核酸的所述至少一种焚光标记的信号强度。
[0165]在测量所述信号强度之前，可以任选地漂洗与含有荧光标记的温育溶液一起温育的细胞样品，以增强信号的信号/背景比例。这些漂洗溶液可以含有生理学更高盐浓度或和/或去污剂的缓冲液以降低非特异性相互作用和背景信号，所述去污剂例如NP-40、Tween 20、Tween 80、Triton XlOO等等。这种漂洗缓冲液可以包含例如含有0.05 %TWeen20的PBS pH7.4。可以使用任何生理学pH的等渗缓冲液。所述漂洗步骤是任选的，因为荧光标记当结合至双链核酸时显示比非结合的标记更高的信号强度。然而，为了更好的信号/背景比例，漂洗步骤可以是优选的。
[0166]用能够激发所述荧光标记的光源进行激发。一般而言，所述光源发射波长在大约10nm至大约800nm之间。所述激发波长依赖于使用的焚光标记的性质。在溴化乙锭、碘化吡啶和DAPI的情况中，典型地使用从大约300nm至大约550nm的紫外光。这个波长范围对于其他标记例如碘化吡啶等等也是优选的。
[0167]根据使用的荧光标记的吸收谱，所述光源可以发射单色光或复色光。
[0168]应当了解所述荧光标记的信号强度对于不同细胞应当各自测量，这在使用显微镜时是必需的，以使得细胞可以在空间上分离。
[0169]对于检测所述信号，可以使用能够检测荧光信号的显微镜。在本发明一个优选的实施方案中，同样的显微镜可以提供所需要的设备以便也以相差观察待检细胞。可以用于检测荧光信号的一种显微镜类型可以是共聚焦激光扫描显微镜。然而，对于本发明的方法典型地预见的应用，具有需要的滤镜、检测单元、软件等等的相差显微镜可能是足够的。
[0170]信号强度(即被吸收的或透射的光的量)的确定通过使用典型地用于这些目的的仪器进行。这些仪器中的一些已经在上文实施方案I的文中得到描述。
[0171]因此，可以例如也使用连接至用于当用上述光源激发时观察细胞的显微镜光圈的电荷耦合装置或数码照相机。当然也可以使用胶卷等等。
[0172]荧光测量同样可以用任何标准滤镜(filter cube)(由阻挡滤片、激发滤片和二色镜组成)或针对特殊用途的任何定制滤镜进行，前提是发射谱处于系统灵敏度的谱域内。谱生物成像(spectral b1imaging)也可以与任何标准空间滤波方法例如暗场和相差和甚至偏振光显微术结合使用。
[0173]可以使用例如电荷耦合装置(CCD)记录由上文所述的荧光标记产生的信号的荧光光学读数，其中所述电荷耦合装置为了定性区分光学效应(散射、反射)(通过反射光显微术或透射光显微术)实现荧光团