肿瘤血清标志物ca153、cea、hcg乳腺癌三联诊断试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医疗检测领域，具体涉及肿瘤血清标志物CA153、CEA、HCG乳腺癌三联 诊断试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 在目前乳癌发病机理不清楚的情况下，最好办法就是早期发现、早期诊断与早期 治疗，这是提高乳腺癌疗效的关键。乳腺癌是世界上最常见的上皮细胞肿瘤，对人类的健康 和生存构成重大威胁，是世界各国面临的最重要的社会问题之一。时至今日，乳腺癌占全身 恶性肿瘤的7% -10%，其发病率呈逐年上升趋势，自1980年以来每年以3%的速度增长， 特别是北美、西欧等发达国家，表现的尤为明显。全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌， 其中，有50万妇女死于乳腺癌。2006美国癌症协会，国际癌症学会和国际乳腺癌联合体有 关乳腺癌的统计资料显示：在女性人口中，每8位就有1位将遭受乳腺癌的威胁。平均每2 分半钟就有1位女性被诊断为乳腺癌患者。在2006年，平均每13分钟就有1位女性死于 乳腺癌。仅在2006年，有212920位女性受到乳腺癌的侵袭，大约有40970位患者将面临死 亡。
[0003] 肿瘤标记物是指肿瘤细胞直接合成和分泌的肿瘤相关抗原、活性蛋白、激素、受 体、酶或同工酶，它们当中的一些可以通过循环进入血液或体液。血液和体液中的肿瘤标志 物可通过生物化学反应、放免法、酶免法、电化学发光等方法检测出来。发现肿瘤标记物对 肿瘤诊断、治疗、监测复发、判断疗效和抗癌药物设计有十分重要的意义。当前，医院通常使 用的肿瘤标记物多达数十种，如血清中的AFP(甲胎蛋白）、CEA(癌胚抗原）、CA125 (糖类抗 原125)、CA199 (糖类抗原199)、CA153 (糖类抗原153)、CA50 (糖类抗原50)、CA242 (糖类 抗原242)、CA72-4 (糖类抗原72-4)、NSE(神经原特异性烯醇化酶）、SCC(鳞癌相关抗原）、 HTG(甲状腺球蛋白）、TPS(组织多肽特异性抗原）、PSA(前列腺特异抗原）、fPSA(游离前列 腺特异抗原）、cPSA(结合型前列腺特异抗原）、FT3 (三碘甲状腺原氨酸）、FT4 (甲状腺素）、 TSH(促甲状腺素）、CT(降钙素）、PTH(甲状旁腺素）、HCG(绒毛膜促性腺激素）、E2 (雌二 醇）、P(孕酮）、LH(黄体生成素）、FSH(促卵泡生成素）、PRL(催乳素）、GH(生长激素）、 ACTH(促肾上腺皮质激素）、VMA(尿香草扁桃酸）等，但这些标记物的特异性和识别范围并 不十分理想，肿瘤的不同时期和肿瘤细胞的类型差别会出现不同的预后结果。在肿瘤检测 中，由于单项肿瘤标志物敏感性和特异性不能满足临床诊断的需要，通常采用有针对性的 联合检测才能为临床诊断提供有价值的数据；例如，检测肝癌时通常联合检测AFP、CEA、SF 和CA199,检测大肠癌时测CEA、SF、CA199和CA50,检测卵巢癌时测CEA、AFP和CA125,检测 肺癌时测CEA、CA50和CY211，检测乳腺癌时测CEA、SF、CA153和CA50,检测前列腺癌时测 PSA和FPSA。这样势必导致患者为获得对临床诊断有意义的数据需要检测多项生理指标， 而检査这些指标时通常需付千元以上的检测费，对患者本人和社会均带来很大的负担。所 以，研发新的检测瘤标志物试剂盒是当前许多著名研宄机构和制药企业的重点研宄课题。
[0004] CA153是一种与肿瘤相关的粘蛋白抗原，其分子是0-连接的低聚糖蛋白，分子量 很大。目前，已知由人类MUC-I基因编码的与乳腺癌相关的抗原分别有MAM6、乳汁粘蛋白、 和CA153。用这些抗原制备的单克隆抗体，能够不同程度地定量检查患II期或III期乳腺 癌妇女的癌症复发情况。据有关资料报道，肿瘤相关抗原CA153对预测II期或III期乳腺 癌病人复发情况具有较高的特异性。美国食品和药品管理局（FDA)近期已批准使用CA153。 临床上，通常用40U/ml(RIA)作为正常值的上限。对乳腺癌和卵巢癌转移的病人，特别是经 治疗后临床上无疾病症状的病人，在定期进行血清CA153检查时发现，测定值大于40U/ml 的病人比测定值小于40U/ml或等于40U/ml的病人，其存活率要低得多。
[0005] 组织多肽特异抗原CEA，血清中组织多肽特异抗原含量的高低是衡量肿瘤细胞分 裂和增殖活性的一个较为特异的指标。研宄表明，组织多肽特异抗原在肿瘤的早期诊断、预 测复发和转移、评价预后方面有独特的价值。与传统的肿瘤标志物如甲胎蛋白、癌胚抗原等 不同的是，组织多肽特异抗原是"肿瘤活性依赖型"的，它在血清中含量的高低与正在分裂、 增殖的肿瘤细胞的数目有关，即与肿瘤的活性有关；而甲胎蛋白、癌胚抗原等则是"肿瘤容 量依赖型"的，与肿瘤的瘤体负荷即肿瘤细胞的数目有关。因此，在肿瘤的早期，在出现肉眼 复发或转移之前，由于肿瘤细胞数目较少，那些反映肿瘤容量的标志物的血清水平往往是 很低的，而此时肿瘤细胞分裂、增殖活跃，因而组织多肽特异抗原含量可以很高，从而有利 于早期发现、早期诊断和防治。
[0006] HCG在正常情况下无表达或低表达，作为一种新的上皮来源性质的肿瘤标志物，近 几年来在肿瘤临床的应用越来越广泛，在许多上皮性癌如肺癌、鼻咽癌等都有不同程度的 检出率；文献报道乳腺癌患者血清HCG水平与临床分期有关，但其阳性率不高，但与良性肿 瘤组差异有显著性，HCG阳性率随临床分期及有无转移或复发的程度增加而上升。因此HCG 的检测亦可出现假阳性，这需要结合临床资料及通过追踪观察加以排除。
[0007] 单独检测上述某一肿瘤标志物指标，并不能提供更多的信息，检测灵敏度和特异 性都比较低，很难检测出早期或复发乳腺癌患者，容易出现误诊或漏诊。
【发明内容】
[0008] 本发明目的在于提供一种新的乳腺癌诊断试剂盒，相比于现有的乳腺癌诊断试剂 盒，本发明乳腺癌诊断试剂盒具有更高的灵敏度高和更强的特异性强。
[0009] 针对CA153对乳腺癌诊断具有特异性高的特点，CEA在肿瘤的早期诊断、预测复发 和转移、评价预后方面有独特的优势，HCG在乳腺癌临床分期有关及区分恶性与良性肿瘤方 面的特性，本发明应用免疫层析法将以上三种抗原联合使用，从而大大提高了乳腺癌临床 检测的灵敏度及特异性，相对于单检试剂具有灵敏度高及特异性强等特点，同时，每种肿瘤 标志物的显色颜色不同，结果判断更加直观。
[0010] 具体的，本发明目的是通过以下技术方案来实现的：
[0011] 一种乳腺癌胶体金三联检诊断试剂盒，包括反应卡、吸滴管、血清加样杯和一次性 注射器，其中，所述的反应卡自下而上依次由样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤维素膜 和吸水垫连接在一起后固定于背衬上而组成；
[0012] 其中，所述的胶体金标记的结合垫按照以下方法制备得到：将CA153单克隆抗体、 CEA单克隆抗体和HCG单克隆抗体分别用金溶胶粒标记后，将其混合，包被于玻璃纤维上， 即得；
[0013] 更优选的，所述的胶体金标记的结合垫按照以下方法制备得到：以氯金酸-柠檬 酸三钠还原法（Frens法）制备不同直径的胶体金溶液，用0. 2MK2C03调至pH7. 5,分别将 CA153单抗用粒径为24. 5nm的金溶胶粒标记，CEA单抗用粒径为41nm的金溶胶粒标记， HCG5单抗用粒径为71nm的金溶胶粒标记，标记是时间分别为30分钟，加入终浓度为10mg/ ml牛血清白蛋白（BSA)，lmg/mlPVP封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，沉淀分别用 工作液进行复溶，将金溶胶粒标记的3种单抗溶液混合后（优选为等比例混合），包被于玻 璃纤维上，即得。
[0014] 在本发明进