一步地实施方案中，所述工作液为含有0.lmg/ml的鹿糖，lmg/ml的酪 蛋白和0. 5mg/ml的维生素C的PBS缓冲液，pH值为6. 0。
[0015] 所述的硝酸纤维素膜上含有由抗CA153单克隆抗体、抗CEA单克隆抗体和抗HCG 单克隆抗体分别包被而成的3条检测线和1条由羊抗鼠IgG包被而成的对照线；更优选的， 所述的硝酸纤维素膜上的3条检测线和1条对照线按照以下次序排列而成：从靠近吸水纸 一端到靠近胶体金结合垫一端依次为为羊抗鼠IgG对照线、抗CA153单克隆抗体检测线、抗 CEA单克隆抗体检测线和抗HCG单克隆抗体检测线。
[0016] 其中，所述的硝酸纤维素膜可以由尼龙膜等代替。
[0017] 所述的背衬可以是各种硬质的支持物，只要具有一定的硬度具有附载或支持的功 能都可用于本发明。
[0018] 本发明试剂盒的使用方法及评测标准：
[0019] 用吸滴管将待检样品（血清）收集在血清加样杯中，将反应卡的下端（吸水纸一 端）浸入血清中，等候约1分钟，将样品完全被吸收之后，取出反应卡进行鉴定。根据胶体 金标记的物种抗体的颜色变化进行鉴定，自吸水纸至样品垫分别为检测CA153、CEA、HCG的 条带，相对应的颜色分别为橙红色、红色和紫红色。
[0020] 临床应用结果表明，本发明胶体金三联检诊断试剂盒可以准确的检测出早期或复 发乳腺癌患者，灵敏度和特异性都比较高，检测过程非常快速（全部检测过程仅需3-15分 钟）、具有简便、价格低廉、人为操作误差小、稳定性好等优点。
[0021] 本发明试剂盒中的反应卡；从左至右依次由样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤 维素膜和吸水垫连接在一起后固定于背衬之上，其中，在硝酸纤维素膜的胶体金标记抗体 由右到左依次为羊抗鼠IgG、CA153单克隆抗体、CEA单克隆抗体、HCG单克隆抗体。
【具体实施方式】
[0022] 下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求 保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附 权利要求书记载的内容为准。
[0023] 实施例1
[0024] 1、含有3条检测线和1条对照线的硝酸纤维素膜的制备
[0025] 检测线和对照线包被
[0026] 三种单抗在硝酸纤维素膜上的位置，自样品垫到吸水纸的方向，分别为HCG单克 隆抗体、抗CEA单克隆抗体及抗CA153单克隆抗体。
[0027] 检测线划线：分别将抗HCG单克隆抗体、抗CEA单克隆抗体及抗CA153单克隆抗 体装入BioDot喷膜机中（蛋白微量喷膜系统），在硝酸纤维素膜上按0. 1y1/mm的量划上 (膜规格为25_X310mm)。
[0028] 对照线划线：羊抗鼠抗体包被液装入BioDot喷膜机中（蛋白微量喷膜系统），在 硝酸纤维素膜上按〇. 1U1/mm的量划上。
[0029] 包被：37°C包被2小时；
[0030] 封闭：37 °C封闭30分钟；
[0031] 干燥：将包被后的硝酸纤维素膜放入真空干燥器内干燥20小时，真空度0. 1。
[0032] 2、胶体金标记的结合垫制备
[0033] 胶体金标记：分别对单抗溶液透析除盐过夜，调整蛋白质浓度至lmg/ml;在电磁 搅拌下，CA153单抗用粒径为24. 5nm的金溶胶粒标记，CEA单抗用粒径为41nm的金溶胶粒 标记，HCG5单抗用粒径为71nm的金溶胶粒标记，最终检测CA153、CEA、HCG的条带相对应颜 色为橙红、红、紫红。然后等比例将3种免疫金混合，得到混合免疫金；
[0034] 具体步骤为：用0.2MK2C03调至pH7.5,标记是时间为30分钟，加入终浓度为 10mg/ml牛血清白蛋白（BSA)，lmg/mlPVP封闭20min，12000r/m离心30分钟，弃上清，沉淀 分别用工作液进行复溶，将金溶胶粒标记的3种单抗溶液混合后（优选为等比例混合），包 被于玻璃纤维上，即得。工作液为含有0.lmg/ml的鹿糖，lmg/ml的酪蛋白和0. 5mg/ml的维 生素C的PBS缓冲液，pH值为6. 0。
[0035] 包被：胶体金稀释液稀释至0D= 6. 0,10mmX310mm玻璃纤维在溶液中浸泡5-10 分钟；
[0036] 干燥：将标记后玻璃纤维放入真空干燥器内干燥20小时，取出密闭保存待用。
[0037] 3、组装
[0038] 备料：样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬等按生产工艺要求裁成 一定的规格和尺寸。
[0039] 黏贴：按生产工艺要求将各组分黏贴在白色塑料板上。
[0040] 裁切：用切条机将组装好的反应板切成3_宽的试纸条。
[0041] 装袋：装入铝箔袋内，外加干燥剂防潮。机器封口。
[0042] 实施例2灵敏度试验
[0043] 采用CEA、CA153和HCG标准品配制不同浓度的供试溶液，具体如下：
【主权项】
1. 一种乳腺癌胶体金三联检诊断试剂盒，包括反应卡、吸滴管、血清加样杯和一次性注 射器，其中，所述的反应卡自下而上依次由样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤维素膜和 吸水垫连接在一起后固定于背衬上而组成。
2. 根据权利要求1所述的三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述的胶体金标记的结合 垫按照以下方法制备得到：将CA153单克隆抗体、CEA单克隆抗体和HCG单克隆抗体分别用 金溶胶粒标记后，将其混合，包被于玻璃纤维上，即得。
3. 根据权利要求2所述的三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述的胶体金标记的结合 垫按照以下方法制备得到：以氯金酸-柠檬酸三钠还原法（Frens法）制备不同直径的胶 体金溶液，用〇. 2M K2CO3调至pH7. 5,分别将CA153单抗用粒径为24. 5nm的金溶胶粒标记， CEA单抗用粒径为4 Inm的金溶胶粒标记，HCG5单抗用粒径为7 Inm的金溶胶粒标记，标记是 时间分别为30分钟，加入终浓度为lOmg/ml牛血清白蛋白（BSA)，lmg/mlPVP封闭20min， 12000r/m离心30分钟，弃上清，沉淀分别用工作液进行复溶，将金溶胶粒标记的3种单抗溶 液混合后（优选为等比例混合），包被于玻璃纤维上，即得。
4. 根据权利要求3所述的三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述工作液为含有0.1 mg/ ml的鹿糖，lmg/ml的酪蛋白和0. 5mg/ml的维生素C的PBS缓冲液，pH值为6. 0。
5. 根据权利要求1所述的三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上含 有由抗CA153单克隆抗体、抗CEA单克隆抗体和抗HCG单克隆抗体分别包被而成的3条检 测线和1条由羊抗鼠IgG包被而成的对照线。
6. 根据权利要求1所述的三联检诊断试剂盒，其特征在于，所述的背衬可以是各种硬 质的支持物。
【专利摘要】本发明属于医疗检测领域，具体涉及肿瘤血清标志物CA153、CEA、HCG乳腺癌三联诊断试剂盒及其制备方法。其由反应卡、吸滴管、血清加样杯和一次性注射器，其中，所述的反应卡自下而上依次由样品垫、胶体金标记的结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫连接在一起后固定于背衬上而组成。
【IPC分类】G01N33-577, G01N33-574
【公开号】CN104849465
【申请号】CN201510292843
【发明人】陈立国, 胡申刚
【申请人】广州华弘生物科技有限公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月29日