牛奶中抗生素残留的检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及牛奶中抗生素残留的监测方法及其应用，属于食品安全领域，特别是 食品安全检测领域。
【背景技术】
[0002] 牛奶富含除了膳食纤维外的人体所需要的所有营养物质，其营养之高是其他食物 不可替代的。新鲜牛奶和奶制品已经成为人们（尤其是老人和儿童）生活食品中的重要 组成部分。近年来，随着我国畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高，为了预防疾病的 发生和治疗乳房炎等疾病，养殖者会在牛饲料中及饮用水中添加含有一定比例抗生素的饲 料添加剂，然而，这样将不可避免地造成牛奶中抗生素的残留。若长期饮用含有抗生素的牛 奶，牛奶中的抗生素可通过食物链进入人体，无疑是等于长期服用小剂量的抗生素。对抗生 素过敏体质的人服用残留抗生素的牛奶后可引发过敏反应。正常饮用者，会导致体内的某 些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素残留不仅 危害人类健康，同时也影响牛奶的品质。世界粮农组织（FA0)、世界卫生组织（WHO)的食品 法对牛奶中抗生素最高残留量作了详细的规定。我国农业部2001年颁布实施了《无公害食 品生鲜牛乳行业标准》。因此，建立一种，简单、快速、有效地检测牛奶中多种抗生素残留的 方法是非要必要的。
[0003] 由于磺胺类、喹诺酮类、内酰胺类、四环素类、氯霉素类共5大类33种兽药的 药物，其化学分子结构和化学性质差异较大，同时对牛奶中多种抗生素残留的同时检测有 一定困难，目前还没有文献报道。对于牛奶中抗生素残留分析，固相萃取技术、固相微萃取 技术以及基质固相分散等前处理技术已经被应用到样品前处理步骤中，以用来解决样品分 析测试中的基质干扰问题。其中，固相萃取技术的应用最为广泛，但是应用在牛奶中抗生素 残留检测的前处理中，固相萃取技术却普遍存在样品处理过程复杂、有毒试剂接触多、耗材 消耗量大、需要额外氮吹、重现性差和无法实现全自动联机等问题。特别是四环素类等药 物，由于其与蛋白质或者矿物质结合，形成结合态，因此更加加重了牛奶中残留抗生素的检 测难度。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对目前牛奶中抗生素残留的检测问题，提供一种简单、快速 的检测方法，从而可以同时检测牛奶中磺胺类、喹诺酮类、内酰胺类、四环素类、氯霉素 类共五大类33种兽药残留。
[0005] 本发明所公开的牛奶中抗生素残留的检测方法，为在线固相萃取一高效液相色 谱一质谱联用检测方法。
[0006] 其中：在线固相萃取采用C18柱或者HLB柱，所述在线固相萃取的淋洗程序包括以 下步骤，首先依次通过甲醇-水-缓冲溶液活化，具体程序为，甲醇以5mL/min的淋洗速度 淋洗0. 2min，水以5mL/min的淋洗速度淋洗0. 4min，缓冲溶液以5mL/min的淋洗速度淋洗 0. 6min，然后将待测牛奶样品上样，具体程序为，水以0. 5mL/min的淋洗速度淋洗1. 6min， 之后利用甲醇进行洗脱，具体程序为，甲醇以〇. 15mL/min的淋洗速度淋洗2. 6min，最后先 后通过水一甲醇进行冲洗，具体程序为，水以5mL/min的淋洗速度淋洗2. 8min，而后甲醇以 5mL/min的淋洗速度淋洗3. Omin，
[0007] 这里我们使用的缓冲溶液为磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐中的任意一种。
[0008]所述高效液相色谱采用C18分析柱，柱温为30°，采用甲酸水/甲醇作为洗脱液， 利用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱梯度以体积计分别为95:5、75:25、5:95、95:5，各梯度 洗脱时间分别为 2. 5min、3. 5min、4. 0min、2. 5min。
[0009] 所述质谱采用离子化电喷雾，电喷雾离子源为HESI-II，毛细管温度为350°C，鞘 气流速50L/min，辅助气流速6L/min，吹扫气流速3L/min，喷雾电压为3KV，透镜电压为50V， 采用正离子和负离子模式分别采集数据或者正负离子同时切换采集数据，一级全扫描的分 辨率R = 70000,扫描范围100~1000m/z。
[0010] 进一步地，我们还公开了所述待测牛奶样品的制法为：⑴将待测牛奶与蛋白沉 淀剂混合均匀，向混合均匀后的溶液中加入缓冲溶液，调节pH至3. 5~7. 5,（2)将步骤（1) 得到的混合物离心、过滤，收集上清液，即为待测牛奶样品。其中优选以下任意一种或者几 种优选条件，
[0011] 所述蛋白沉淀剂的加入量为待测牛奶加入重量的〇. 2~5倍，
[0012] 所述蛋白沉淀剂优选为乙酸锌水溶液、乙酸铅水溶液、乙酸铵溶液、三氯乙酸溶 液、甲醇、乙腈或者冰乙酸水溶液中的任意一种，其中冰乙酸水溶液优选为1 %~10 %的冰 乙酸水溶液。
[0013] 所述缓冲溶液的加入量为待测牛奶加入重量的0. 1~0. 5倍；
[0014] 所述缓冲溶液为磷酸盐水溶液、醋酸盐水溶液或者柠檬酸盐水溶液中的任意一 种；缓冲溶液的浓度范围为〇. 5~5. Omol/L。
[0015] 所述离心条件为600~3000r/min，离心时间为3~8min。
[0016] 在进样前，需要对上清液进行过滤处理，优选这里采用滤膜为平均孔径为0. 45ym 的滤膜。
[0017] 进一步地，我们还公开了前述牛奶中抗生素残留的检测方法在牛奶抗生素残留定 量检测中的应用。
[0018] 当定量检测时，需要以不同的抗生素标准品制作标准液，采用内标法绘制标准工 作曲线。其中标准曲线的横坐标为标准液浓度，纵坐标为标准溶液峰面积与内标面积比值。
[0019] 最后，我们还公开了前述牛奶中抗生素残留的检测方法在牛奶抗生素残留监测中 的应用，通过比对标准品与样品的色谱峰保留时间和精确质量数偏差确定样品中是否含有 某种或者某几种抗生素。
[0020] 本实验所采用的在线固相萃取技术是一种全自动的在线样品前处理方式，通过优 化固相萃取富集条件、分析色谱柱、流动相对多种抗生素的保留和选择性的影响，首次实现 牛奶基质中多种抗生素的快速检测。在线联接可避免因复杂前处理过程而带来的分析物 损失，减少操作者因溶剂挥发与有毒溶剂的接触，提高检测效率和通量，具有广阔的应用前 景。
[0021] .本发明所需样品量及试剂用量少，只需要10-100yl。本发明样品前处理简单， 牛奶样品只需沉淀蛋白加入缓冲溶液调节pH后即可直接进样，省去了传统固相萃取处理 时的氮吹、浓缩等步骤。本发明样品分析时间短，检测速度快，一个样品仅需15. 5min。本发 明对目标化合物的选择性强，抗干扰能力强，能够排除干扰组分而从复杂基质中提取出目 标物质。本发明所建立的在线固相萃取、色谱质谱条件下进行测定，在实验浓度范围内，相 关系数r能够达到0. 999以上，回收率在70. 3-125. 8%之间，当日内和几日间精密度实验 的相对标准偏差都小于5. 0%。牛奶中抗生素残留的快速检测为乳品加工企业生产降低成 本、减轻运作风险提供了保证。
【附图说明】
[0022] 图1为实施例1中牛奶样品中的质谱图。
【具体实施方式】
[0023] 实施例1.巴氏灭菌乳中多种抗生素残留的检测
[0024] ⑴样品的制备
[0025] 准确称取牛奶样品1. 00g(±0.0 lg)于离心管中，加入0? 5ml浓度为lmol/L的乙 酸锌溶液，涡旋混匀后，再加入lmol/L磷酸缓冲溶液lml，控制溶液