检测重组蛋白表达情况的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，用于检测重组抗原表达水平，尤其是涉及一种检测重组蛋白表达情况的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]DNA重组技术是现代生物学发展的一个重要分支，是分子生物学发展的突出领域，极大地促进了生命科学领域研究及应用的进步。其中，将某种目的蛋白的基因构建在表达载体上，利用某种生物细菌或细胞来大量表达目的蛋白，也就是重组蛋白的表达是DNA重组技术的重要应用之一。重组蛋白表达技术的出现使得人们可以利用基因工程的手段生产所需要的氨基酸序列(蛋白质)，进而大量获得过去难以获得的生物体内、外的蛋白质，同时也是研究蛋白质功能结构，以及筛选靶向药物的有力工具，在基础科学以及医药学领域发挥了重要作用。
[0003]目前重组蛋白表达系统有许多，根据表达蛋白的宿主的不同可以分为原核表达系统、真核表达系统。不同的表达系统有各自的优缺点，通常根据目的蛋白的性质和后续的应用进行选择。原核表达系统是利用特定的大肠杆菌工程菌株作为宿主菌来表达外源重组蛋白的一个系统，由于其遗传背景清楚，培养操作简单、转化效率高、生长繁殖快、成本低廉，且可以快速大规模地生产目的蛋白等优点而被广泛地用于外源蛋白的表达。目前，多数表达载体常带有His标签，主要是在表达后蛋白纯化中发挥作用。从本质上说，His标签是一种亲和性标签，与IMAC (固定化金属螯合亲和层析)亲和，使目的蛋白的纯化过程变的更加程序化，更具可控性。
[0004]重组蛋白表达量受多种因素的影响，如诱导表达时间、培养温度、IPTG浓度等。重组蛋白表达量的多少对后续工作非常关键。因此，建立一种快速定量检测重组蛋白表达量的方法有利于提高工作效率和准确性。目前检测重组蛋白的方法主要是聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(western-blot)。而SDS-PAGE只能对重组蛋白表达量的相对多少进行估算，不能准确定量，而且需要一定的表达量才能肉眼识别出来。免疫印迹试验是将电泳分离后蛋白质条带转移到硝酸纤维膜上，再利用抗原与相应的抗体进行免疫反应后，通过相应的显色反应，以检测相应目的蛋白的表达量。上述重组蛋白方法比较耗时，操作繁琐，不适合应用于大批量检测。另外，利用重组荧光素酶和绿色荧光蛋白来检测重组蛋白表达量也较常见。绿色焚光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光，以此来检测重组蛋白，这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。荧光素酶(Luciferase)是自然界中能够产生生物萤光的酶的统称，在相应化学反应中，萤光的产生是来自于荧光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷(ATP) ο这两种方法成本较高、不稳定、不能准确定量，而且容易覆盖下游小分子目的蛋白，降低检测准确性，甚至影响重组蛋白的生物学活性。
【发明内容】
[0005]有鉴于此，本发明旨在提出一种检测重组蛋白表达情况的试剂盒及其使用方法，以实现快速定量检测目的蛋白的目的。
[0006]为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的:
[0007]一种检测重组蛋白表达情况的试剂盒，包括偶联抗His-标签抗体的受体微球、生物素标记的针对目的蛋白的多克隆抗体、亲和素标记的供体球；优选的，还包括生物素化抗体稀释液、受体微球稀释液。所述生物素标记的多克隆抗体，针对目的蛋白抗体。
[0008]优选的，还包括发光反应板，优选的，所述发光反应板为96孔发光检测板。
[0009]本发明还提供了使用如上所述的检测重组蛋白表达情况的试剂盒进行检测的方法，包括如下操作步骤，
[0010]I)将诱导表达后的大肠杆菌进行超声破碎，即得到带有His标签目的蛋白的破碎菌液(待检样本)；
[0011 ] 2)将偶联抗His-标签抗体的受体球溶液、带有His标签目的蛋白的破碎菌液、生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体溶液加入发光反应板混合，做2?4个复孔，在37°C下温育0.5?1.5小时，优选的，温育I小时；同时进行阴性对照，所述阴性对照的操作是将偶联抗His-标签抗体的受体球溶液、未诱导表达的超声破碎菌液、生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体溶液加入发光反应板混合，做2?4复孔，温育温度以及时间与带有His标签目的蛋白的破碎菌液的温育相同；
[0012]3)在避光条件下，向每个孔加入亲和素标记的供体球溶液，在37°C下温育10?20min ;优选的，15min ；
[0013]4)读数，结果判定；如待检测菌液的信号值多2阴性对照的信号值，则判定有重组蛋白的大量表达，并且，信号值越大，表达量水平越高；优选的，用光激发发光检测仪在615nm下检测光信号。
[0014]本发明采用目前最先进的基于活性氧激发能量转移的均相发光免疫分析系统，即基于抗原抗体特异性结合和生物素-亲和素放大系统来检测重组蛋白表达量。将受体球-His-tag Ab (偶联抗His-标签抗体的受体球)、带有His-标签目的蛋白的破碎菌液和B1-抗目的蛋白Ab (生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体)混合孵育，如果目的蛋白成功表达，则会形成受体球-His-tag Ab-目的蛋白-B1-抗目的蛋白Ab复合物，再加入亲和素标记的供体球，则亲和素与生物素结合，利用活性氧激发能量转移，产生发光现象，通过仪器读取信号值。
[0015]优选的，步骤I)中，带有His标签目的蛋白的破碎菌液的0D_nni为0.1?0.5。
[0016]优选的，所述步骤2)中，偶联抗His-标签抗体的受体球溶液、带有His标签目的蛋白的破碎菌液、生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体溶液的体积比为1:1:1。
[0017]优选的，所述偶联抗His-标签抗体的受体球溶液是偶联抗His-标签抗体的受体球与受体稀释液按体积比1:50进行调配的，优选的，受体稀释液为Tris-HCl缓冲液，其pH为 8.0，浓度为 0.lmol/Lo
[0018]优选的，所述生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体溶液是生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体与生物素抗体稀释液按体积比1:2000进行调配的；优选的，所述生物素抗体稀释液为PBS缓冲液，其pH为7.4，浓度为0.lmol/Lo
[0019]优选的，步骤3)中，向每个孔加入的亲和素标记的供体球溶液与带有His标签目的蛋白的破碎菌液的体积比为1: 7，优选的，亲和素标记的供体球溶液的浓度为20微克/毫升。
[0020]本发明同时提供了如上所述的试剂盒在检测重组蛋白表达中的应用。
[0021]相对于现有技术，本发明所述的试剂盒，具有以下优势:
[0022](I)操作简单两次温浴累计75min，整个检测过程不超过90min，而常用的免疫印迹试验至少需要2个工作日(48h)。特别是本方法属于均相发光免疫分析系统，整个检测过程无“洗涤”环节，检测效率更高，精密度更强。
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