023](2)敏感度高采用基于活性氧传递的发光免疫分析体系，具有较高的敏感性，待检组分不需纯化分离，便可准确测定该菌株的目的蛋白的表达水平，能够实现对重组蛋白表达量的快速定量检测。
[0024](3)通用性较强本系统中偶联抗His-tag抗体的受体微球、与亲和素标记的供体球为通用检测试剂，适合所有携带His-tag表达质粒的表达系统，只要更换生物素标记抗体即可拥有任何目的蛋白的检测。而生物素标记抗体来源方便，即使需要亲自标记也非常简单。
【附图说明】
[0025]构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
[0026]图1为重组蛋白定量检测均相发光免疫分析原理示意图；
[0027]附图标记说明:
[0028]1-待检目的蛋白，2-His标签，3_偶联抗His-tag抗体的受体球，4_生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体，5-亲和素标记的供体球。
【具体实施方式】
[0029]下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0030]实施例一
[0031]试剂盒的组成:96孔发光检测板、用于偶联抗His-tag抗体的受体微球和亲和素标记的供体球购自博阳生物科技(上海)有限公司；生物素标记的多克隆抗体购自美国sigma公司；生物素化抗体稀释液和受体微球稀释液均实验室常用缓冲液，所述生物素抗体稀释液为PBS缓冲液，其pH为7.4，浓度为0.lmol/L ;受体稀释液为Tris-HCl缓冲液，其pH 为 8.0，浓度为 0.lmol/L
[0032]以在原核表达系统-大肠杆菌中表达重组蛋白β -乳球蛋白的检测为例，具体方法如下:
[0033](I)准备阶段:将诱导表达β -乳球蛋白的菌液进行超声破碎，调0D_nni= 0.1?0.5之间，同时将未诱导表达的菌液做同样处理；将偶联抗His-tag抗体的受体微球用受体微球溶液1:50稀释，备用；将生物素标记抗乳球蛋白多克隆抗体用生物素化抗体溶液1:2000稀释，备用。
[0034](2)将 25 μ I 受体球-His-tag Ab (1:50 稀释)、25 μ I 破碎菌液(0D600nm = 0.1 ?0.5)和25 μ I B1-抗β -乳球蛋白抗体(1: 2000稀释)加入96孔发光检测板混合温育，37°C，I小时，同时将未诱导表达的超声破碎菌液做阴性对照，分别做3个复孔。
[0035](3)在避光条件下，向每个孔加入175 μ I亲和素标记的供体球溶液，37°C温育15min。亲和素标记的供体球溶液的浓度为20微克/毫升。
[0036](4)读数，结果判定用光激发发光检测仪在615nm下检测光信号。待检测菌液信号值为695，阴性对照信号值为165，检测值多2阴性对照，所以判定结果为阳性，即有重组蛋白的大量表达。
[0037]以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
【主权项】
1.一种检测重组蛋白表达情况的试剂盒，其特征在于:包括偶联抗HiS-标签抗体的受体微球、生物素标记的多克隆抗体、亲和素标记的供体球；优选的，还包括生物素化抗体稀释液、受体微球稀释液。2.根据权利要求1所述的检测重组蛋白表达情况的试剂盒，其特征在于:还包括发光反应板，优选的，所述发光反应板为96孔发光检测板。3.使用如权利要求1?2所述的检测重组蛋白表达情况的试剂盒进行检测的方法，其特征在于:包括如下操作步骤， 1)将诱导表达后的大肠杆菌进行超声破碎，即得到带有His标签目的蛋白的破碎菌液； 2)将偶联抗His-标签抗体的受体球溶液、带有His标签目的蛋白的破碎菌液、生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体溶液加入发光反应板混合，做2?4个复孔，在37°C下温育0.5?1.5小时，优选的，温育I小时；同时设置阴性对照，所述阴性对照的操作是将偶联抗His-标签抗体的受体球溶液、未诱导表达的超声破碎菌液、生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体溶液加入发光反应板混合，做2?4复孔，温育温度以及时间与带有His标签目的蛋白的破碎菌液的孵育相同； 3)在避光条件下，向每个孔加入亲和素标记的供体球溶液，在37°C下温育10?20min;优选的，15min，亲和素标记的供体球溶液浓度为20微克/毫升； 4)读数，结果判定；如待检测菌液的信号值多2阴性对照的信号值，则判定有重组蛋白的大量表达；优选的，用光激发发光检测仪在615nm下检测光信号。4.根据权利要求3所述的使用检测重组蛋白表达情况的试剂盒进行检测的方法，其特征在于:步骤I)中，带有His标签目的蛋白的破碎菌液的OD_nni为0.1?0.5。5.根据权利要求3所述的使用检测重组蛋白表达情况的试剂盒进行检测的方法，其特征在于:所述步骤2)中，偶联抗His-标签抗体的受体球溶液、带有His标签目的蛋白的破碎菌液、生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体溶液的体积比为1:1:1。6.根据权利要求3或5所述的使用检测重组蛋白表达情况的试剂盒进行检测的方法，其特征在于:所述偶联抗His-标签抗体的受体球溶液是偶联抗His-标签抗体的受体球与受体稀释液按体积比1:50进行调配的，优选的，受体稀释液为Tris-HCl缓冲液，其pH为8.0，浓度为 0.lmol/Lo7.根据权利要求3或5所述的使用检测重组蛋白表达情况的试剂盒进行检测的方法，其特征在于:所述生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体溶液是生物素标记的抗目的蛋白的多克隆抗体与生物素抗体稀释液按体积比1:2000进行调配的；优选的，所述生物素抗体稀释液为PBS缓冲液，其pH为7.4，浓度为0.lmol/Lo8.根据权利要求3所述的使用检测重组蛋白表达情况的试剂盒进行检测的方法，其特征在于:步骤3)中，向每个孔加入的亲和素标记的供体球与带有His标签目的蛋白的破碎菌液的体积比为1:7。9.如权利要求1或2所述的试剂盒在检测重组蛋白表达中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种检测重组蛋白表达情况的试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括偶联抗His-标签抗体的受体微球、生物素标记的多克隆抗体、亲和素标记的供体球。本发明基于抗原抗体特异性结合、生物素-亲和素放大系统、以及活性氧传递均相发光检测体系来检测重组蛋白表达量。将受体球-His-tag？Ab、带有His-tag目的蛋白的破碎菌液和Bio-抗目的蛋白Ab混合温育，如果目的蛋白成功表达，则会形成受体球-His-tag？Ab-目的蛋白-Bio-抗目的蛋白Ab复合物，再加入亲和素标记的供体球，则亲和素与生物素结合，利用活性氧激发能量转移，产生发光现象，通过仪器读取信号值。
【IPC分类】G01N33/68, G01N21/63
【公开号】CN105044047
【申请号】CN201510312076
【发明人】常艳敏, 李会芳, 孙兰菊, 侯丽英, 朱黎娜, 曾昭伟, 张伟
【申请人】天津市南开医院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月9日