用于可逆的离子和分子感测或迁移的纳米孔装置的制造方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2012年3月2日，申请号为201280021765. 2,发明名称为"用 于可逆的离子和分子感测或迀移的纳米孔装置"的申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2011年3月4日提交的美国临时专利申请第61/449, 379号的优先 权，其在此以其整体通过引用并入。
[0004] 政府支持的声明
[0005] 本发明通过根据以下的政府支持作出：由美国航空航天局（NASA)资助的合同号 NCC9-165和NNX08BA47A、由美国国家卫生研究院资助的合同号P01-HG000205、由NASA资助 的合同号NNX09AQ44A以及由美国国家癌症研究所资助的合同号U54CA143803。政府享有本 发明中的某些权利。
[0006] 关于序列表、计算机程序或光盘的引用
[0007] 无。
技术领域
[0008] 本发明涉及纳米材料的领域并且特别地涉及纳米孔装置和传感器。特别地，本发 明涉及使用纳米尺度的离子电流测量来感测和操纵和感测离子和碳水化合物。
【背景技术】
[0009] 下文提出关于本发明的某些方面的背景信息，因为它们可能涉及在详细描述中提 到的技术特征，但是不一定被详细地描述。即，在本发明中使用的单个部分或方法可以被在 下文讨论的材料中更详细地描述，这些材料可以向本领域的技术人员提供进一步的用于制 造或使用本发明的如所要求保护的某些方面的指导。下文的讨论不应当被视为对关于本文 的任何权利要求的信息或所描述的材料的现有技术效果的相关性的承认。
[0010] 纳米孔离子电流调制器
[0011] 固态纳米孔作为可以被用于模仿生物通道、用于纳米颗粒的尺寸选择性合成 的稳定结构，或作为纳米尺度传感器是很受关注的。圆锥形的或不对称的纳米孔是显 示由电压门控的离子电流的一类不同的纳米通道并且可以表现为纳米流体二极管，即 它们展示离子电流整流。几个团队已经开发利用跨越含有不对称纳米孔的膜的离子电 流测量的电传感器（Harrell, C.C.等人·，Resistive-pulse DNA detection with a conical nanopore sensor. Langmuir 22,10837-10843, doi ：10. 1021/la061234k(2006)； Kececi,K., 等人.Resistive-pulse detection of short dsDNAs using a chemically functionalized conical nanopore sensor. Nanomedicine 3,787-796， doi ：10. 2217/17435889. 3. 6.787 (2008) ；Sexton,等人·，Developing synthetic conical nanopores for biosensing applications. Mol. Bia Syst.3,667-685，doi : 10.1039/b708725j(2007) ；Au, M.,等人·Biosensing with Functionalized Single Asymmetric Polymer Nanochannels, Macromol.BioscL 10,28-32，doi ：10. 1002/ mabL200900198(2010))。这样的装置通常通过径迹蚀刻方法制备。从石英毛细管制造的基 于石英的纳米孔展示许多相同的电性质，但是使用激光拉制仪被快速地制备。石英圆锥形 纳米孔也被称为纳米吸量管（nanopipette)，展示其他不对称的纳米通道的许多性质，并且 是有利的，因为孔可以被使用高空间分辨率操纵，这是已经被用于以纳米尺度使细胞成像 的性质。
[0012] 使用圆锥形的纳米孔的研究已经产生挑战现有的关于大块材料的观念的新的化 学现象和电现象。最近，通过对聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET)膜中的圆锥形纳米孔（2至Snm 直径）整流而观察到离子电流振荡，并且被归因于由溶解性弱的盐的受电压诱导的浓缩导 致在孔中的动态沉淀。在氮化硅或硼硅玻璃的大得多的孔中的电流振荡可以在使用具有不 同溶解度的有机分子的两种溶剂的界面处被产生。这些现象提供了实时地并且在纳米尺度 电监测诸如沉淀的非平衡事件的新方式。
[0013] 纳米孔传感器
[0014] 模仿生物通道的稳定性和能力使基于纳米孔的平台是用于研究（生物）分子相互 作用的候选者。固态纳米孔是稳定的，其直径可以通过制造过程来控制并且它们可以被集 成入装置和阵列中。此外，它们的表面性质可以通过化学官能化被容易地调节，允许开发化 学和生物化学响应的纳米孔。基于纳米孔的传感器已经结合有受体，包括蛋白质、DNA、适 体、配体和小生物分子，允许多种分析物被靶向。对于许多固态纳米孔传感器的灵敏性来说 基本的是离子电流整流（ICR)的性质，其来源于溶液中的离子和带电荷的具有不对称形状 的纳米通道或圆锥形的纳米孔的表面之间的选择性相互作用。展示ICR并且被用作传感器 的纳米材料包括在聚合物膜中被径迹蚀刻的纳米孔和石英纳米吸量管。在每个情况下，关 键的挑战是使用合适的受体的表面改性。
[0015] 圆锥形的石英纳米孔也已经为了感测应用被官能化[见，例如，Sa，N.， Fuj V.&Baker,I. A. "Reversible Cobalt Ion Binding to Imidazole-Modified Nanopipettes· "Anal Chem·，82,9663-9666，doi :10. 1021/acl02619j (2010) ;Fu，Y·， Tokuhisaj H. &Baker,I. A. "Nanopore DNA sensors based on dendrimer-modified nanopipettes· "Chem Commun(Comb)，4877-4879，doi :10. 1039Jb910511e (2009); Umeharaj S. ? Karhanekj M. ? Davis,R. ff. &Pourmand, N. "Label-free biosensing with functionalized nanopipette probes. "Proceedinqs of the National Academy of Sciences 106,4611-4616, doi :10. 1073/pnas.0900306106(2009) ;Actis，P·， Makj A.&Pourmand, N. "Functionalized nanopipettes : toward label-free, single cell biosensors. "Bioanalytical Reviews 1，177-185，doi ： 10. 1007/ sl2566-010_0013-y (2010) ;Actis，P·，Je jelowo,0.&Pourmand，N· "Ultrasensitive mycotoxin detection by STING sensors. "Biosensors and Bioelectronics 26， 333-337(2010)]〇
[0016] 经过纳米孔的传输可以被包括电压和压力的多种外部刺激改变（见Lan，W._J.; Holden, D. A. ；ffhite,H.S. ? Pressure-Dependent Ion Current Rectification in Conical-Shaped Glass Nanopores· J. Am. Chem. Soc. 2011，133 (34)，13300-13303.) D 简 单地改变跨越纳米孔的盐梯度可以影响传输，并且这种效应被用于聚焦用于电阻性脉 冲测量的 DNA(见 Wanunu，M. ;Morrison，W. ;Rabin，Y. ;Grosberg，A.Y. ;Meller，A·， Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient. Nat Nano 2010, 5 (2)，160-165·)。纳米孔还可以被建造以响应于刺激，例如 溶剂极性。这可以使用所谓的"毛发状纳米孔"被实现，在其中纳米孔被聚合物装饰（见 Peleg, 0. ；Tagliazucchi, Μ. ； Kroger, Μ. ；Rabin, Υ. ；Szleifer, I. , Morphology Control of Hairy Nanopores· ACS Nano 2011，5 (6)，4737-4747·)。多种人造的纳米孔已经使用表面 改性被建造以用于pH灵敏性。圆锥形的纳米孔已经被用于结合其他的带电荷物质的受体 而改性，其同样地调制电流整流。靶已经包括核酸、金属离子、蛋白质和小分子。在大生物 分子例如核酸和蛋白质的情况下，孔的物理堵塞可能类似地起作用，除了表面电荷的调制。 迄今，电流整流使用小的没有电荷的物质的调制已经被证明是困难的。然而，这样的体系将 把用于响应性纳米孔的刺激扩展至包括药物、肽和碳水化合物。
[0017] 葡萄糖/二醇感测
[0018] 碳水化合物识别对于血糖的监测来说基本的（Kondepati，等人.Anal. Bioanal. Chem. 388, 545-563 (2007)。碳水化合物的检测和定量还可以被在生物过程监测中使用以 及用于基于代谢糖、核酸或糖蛋白的医疗诊断（Timmer，等人.Curr. Op. Chem. Biol. 11， 59-65(2007)。大多数的用于测量葡萄糖的电化学方法依赖于氧化还原酶，例如葡萄 糖氧化酶（Oliver，等人.Diabetic Med.26，197-210(2009)。最普遍的人造受体使用 硼酸，硼酸已经最主要地被用于光学探针（Mader&Wolfbeis，Microchimica Actal62， 1-34(2008)。用于葡萄糖的电化学测量的非酶的方法也已经被开发，大多数依赖于葡萄糖 的氧化（Park，等人· Anal. Chim. Acta 556,46-57 (2006) ;E. T Chen，Nanopore structured electrochemical biosensors, US2008/0237063)〇
[0019] 迄今，在文献中几乎没有关于响应于碳水化合物的纳米流体孔的报道。纳米孔分 析学已经被用于使用电阻性脉冲方法检测小分子，但是该技术通常更适合于蛋白质和其他 的大分子。在Mff 500至10, 000的数量级的寡糖已经使用α溶血素孔的电阻性脉冲技术 被辨别。
[0020] 被受体改性的纳米孔的一个实例与共价地附接的HRP酶共同使用，共价地附接的 HRP酶然后超分子地共辄于Con A，Con A是与HRP分子上的甘露糖单元互相作用的糖结 合蛋白（Ali，等人.Nanoscale 3,1894-1903(2011)。单糖（半乳糖和葡萄糖）的加入与 Con A竞争，改变经过孔的离子电流。两个最近的实例利用硼酸作为化学受体，其中受体被 共价地附接于人造的纳米孔的壁（Sun，Z. ;Han，C. ;Wen，L. ;Tian，D. ;Li，H. ;Jiang，L.，pH gated glucose responsive biomimetic single nanochannels. Chem. Commun.(剑桥，英 国)2012. ；Nguyen, Q. H. ；Ali, M. ；Neumann, R. ；Ensinger, ff. , Saccharide/glycoprotein recognition inside synthetic ion channels modified with boronic acid. Sensors and Actuators B:Chemical 2012,162(1)，216-222·)。在前者的情况下，酸性溶液被需要 以逆转糖结合并且恢复信号。在后者中，可逆的结合未出现。
[0021] 特别的专利和公布
[0022] Karhanek等人在于2010年3月25日公布的美国专利申请公布2010/0072080中 公开了包括具有在其上的用于生物分子的检测的肽配体包括肽和蛋白质的纳米吸量管的 方法和装置。
[0023] Siwy等人在于2010年5月4日授权的美国专利7, 708, 871中公开了具有用于控 制带电荷的颗粒在电解质中的流动的纳米器件的设备。这样的设备包括被聚合物膜箱分割 以用于控制带电荷的颗粒在电解质中的流动的电解槽容器。
[0024] Sa 等人在 Analytical Chemistry 2010,82 (24)，第 9963-9966 页中公开了 由咪挫 封端的硅烷改性的石英纳米吸量管响应于溶液中的金属离子（Co2+)。纳米吸量管的响应通 过离子电流整流比的检查来评估。当纳米吸量管在具有不同PH的溶液之间循环时，被吸附 的Co 2+被从纳米吸量管表面释放，以再生纳米吸量管的结合位点。
[0025] Umehara等人在Proceedings of the National Academy of Sciences，1〇6卷，第 4611-4616页，2009年3月24日中公开了使用已官能化的纳米吸量管电极的无标记的实时 蛋白质测定。在纳米吸量管末端表面上的静电的生物素-链霉亲和素和抗体-抗原相互作 用被显示出影响流过50-nm孔的离子电流。
[0026] Umehara 等人"Current Rectification with Poly-L-Iysine Coated Quartz nanopipettes, 'Wano Lett. 6(11) :2486-2492(2006)公开了使用在浴溶液中的纳米吸量管 的未被涂覆的纳米吸量管和被聚-1-赖氨酸涂覆的纳米吸量管的电流响应。
[0027] Karhanek M.，Kemp J. T.，Pourmand N.，Davis R. W.和 Webb C. D，"Single DNA molecule detection using nanopipettes and nanoparticles'Wano Lett. 2005 年 2 月； 5 (2) :403-7公开了被纳米颗粒标记的单个DNA分子可以通过离子电流的阻塞被检测，因为 它们通过被拉动的玻璃毛细管形成的纳米吸量管末端移位。所公开的装置使用电压钳电 路，其利用在浴中的单一的检测电极检测纳米颗粒-DNA电流堵塞。
[0028] Ying，Liming 在 Biochemical Society Transactions，37 卷，702-706 页，2009 中 综述了纳米吸量管和它们在离子、分子（包括生物分子）和细胞的纳米感测和纳米操纵中 的用途。
[0029] Borghs, Gustaaf等人在于2006年1月5日公布的TO 2006/000064中公开了用于 控制载荷子经过延伸穿过膜的纳米孔的流动的纳米流体装置。
[0030] Sunkara等人在于2005年11月24日公布的美国专利申请公布2005/0260119中 公开了使用微波等离子辅助的化学气相沉积方法合成被称为纳米吸量管的呈锥形晶须形 式的管状碳纳米结构的方法。
[0031] Chen 的于 2008 年 10 月 2 日公布的名称为"Nanopore structured electrochemical biosensors, "的美国20080237063公开了用于直接测量葡萄糖的生物传 感器，该生物传感器附接了具有纳米孔结构和催化活性的环糊精。
[0032] Choi 等人 "B iosensing with conical Iy shaped nanopores and nanotubes，"Phys. Chem. Chem. Phys. 8 :4976-4988(2006)讨论了使用径迹蚀刻工艺合成的 圆锥形的纳米孔的制备和表征。还公开了能够整流在外加的跨膜电位下流过这些孔的离子 电流的圆锥形纳米孔的设计和功能。
[0033] Li 等人 "Development of boronic acid grafted random copolymer sensing fluid for continuous glucose monitoring，nBiomacromolecules 10 (I) :113-118 (2009) 公开了用于基于粘性的葡萄糖感测的生物相容共聚物聚（丙烯酰胺-无规-3-丙烯酰氨基 苯基硼酸）（PAA-无规-PAAPBA)。
[0034] Sun, Z. ；Han, C. ；ffen, L. ；Tian, D. ；Li, Η. ； Jiang, L. ? pH gated glucose responsive biomimetic single nanochannels· Chem. Commun.(剑桥，英国）（2012)描述了 在被苯基硼酸受体共价地改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET)中的被径迹蚀刻的圆锥形 的纳米通道。
[0035] Nguyen, Q. H. ；Ali, M. ；Neumann, R. ；Ensinger, ff. , Saccharide/glycoprotein recognition inside synthetic ion channels modified with boronic acid. Sensors and Actuators B :Chemical 2012,162 (I) ,216-222.)描述了在被苯基硼酸受体共价地改 性的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET)中的被径迹蚀刻的圆锥形的纳米通道。通道响应于单糖 以及糖蛋白。
【发明内容】
[0036] 迄今，分析物与纳米孔传感器的可逆结合已经被证明是挑战性的。然而，这是一个 关键的问题，如果这样的装置将被用于诸如使用一个传感器连续监测或重复测量的应用的 话。单个传感器的多种用途也将克服可再现地产生具有同一尺寸的孔中的问题，这限制了 用于在文献中报道的许多传感器的定量测量。对于这样的应用，纳米吸量管是有希望的平 台，因为传感器末端可以被以纳米尺度的精确性在样品之间或在单一样品内精确地并且快 速地操纵。迄今，对响应pH的官能化的纳米孔已经显示出在快速地可逆的并且选择性的行 为方面最好的性质。被咪唑官能化并且响应于钴离子的纳米吸量管可以通过浸没在具有低 pH 的溶液中被再生，使配体再质子化。（Sa, N. ;Fu，V. ;Baker，L.A. ,Reversible Cobalt Ion Binding to Imidazole-Modified Nanopipettes· Anal. Chem. 2010,82(24)，9963-9966)〇
[0037] 虽然有在纳米孔制造和表面化学中的许多最新的进展，但是上文引用的工作显示 出具有对用于使用碳水化合物作为外部刺激来调制离子电流的新方案的需要。这个问题可 以使用能够与纳米孔界面连接的新的官能化材料解决。
[0038] 以下的概述不意图包括本发明的所有特征和方面，其也不意味着本发明必须包括 在本概述中讨论的所有特征和方面。
[0039] 本发明在某些方面涉及用于在检测样品中的分析物的设备中使用的纳米吸量管， 包括：毛细管部分，其界定所述纳米吸量管的通向纳米孔开口的内部孔隙；所述内部孔隙 适于在其内容纳电极并且适于容纳经过所述纳米孔与外部溶液连通的内部溶液（对于电 极构型，见例如图1，其中孔隙是长形的并且成锥形至开口）；以及在所述纳米孔的内表面 上的涂层，其包含：聚合电解质，其被直接地结合于（即接触）所述内表面（通常是石英）； 以及结合分子，其被连接于所述聚合电解质，特异性地结合选自由离子或小分子组成的组 的分析物。
[0040] 在本发明的某些方面，被连接于聚合电解质的结合分子可以是硼酸用于感测葡萄 糖，和/或聚合电解质可以是聚阳离子，由此涂层的电荷改变；和/或聚合电解质可以是聚 烷基吡啶或聚胺。
[0041] 在本发明的某些方面，聚合电解质/感测分子被施用于纳米孔，从而延伸入纳米 孔中并且部分地堵塞纳米孔，把更多的感测分子暴露于样品。
[0042] 在本发明的某些方面，结合分子是被连接于聚合物或聚合电解质涂层的螯合剂。 聚合物涂层可以还包括在吸量管孔隙和离子结合聚合物（ion binding polymer)之间的聚 合电解质层。层可以呈涂层的