促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法及胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法及胡桃醌与胡桃酮的含量测定方 法。
【背景技术】
[0002] 癌症是威胁人类生命的严重疾病，抗癌药物的研究与开发一直是世界医药学界关 注的热点。癌症的复发和转移是癌症患者两大主要死因，标志着治疗失败。中医药通过多 途径综合治疗及调动机体整体防御体系，在癌症的治疗领域展现出越来越重要的作用。
[0003] 北青龙衣又称核桃青皮，为胡桃科植物核桃揪（juglans mandshurica Maxim)的 未成熟外果皮。主要分布在我国黑龙江省东部，小兴安岭、完达山、老爷岭及张广才岭等山 区。作为一种民间药在我国的应用由来己久，最初记载于《开宝本草》，称之为胡桃青龙，《救 急方》中称之为青胡桃皮，自《山东中草药手册》称之为"青龙衣"后，现多延用此名。其药 性苦、涩，古代医家多以其清热解毒、祛风疗癣、止痛止痢功效入药，近年来因其抗肿瘤效果 突出而备受国内外学者的广泛关注。青龙衣含有萘醌及其苷类、黄酮及其苷类、鞣质、二芳 基庚烷类、萜类、有机酸类等化学成分，具有显著的抗肿瘤活性，对胃癌、肝癌、淋巴癌、乳腺 癌、白血病的肿瘤细胞均具有较好的体内外抑瘤作用。
[0004] 2001年，北青龙衣药材收载于《黑龙江省中药材标准》，2004年黑龙江省中医药科 学院以其为主要原料开发了医院制剂复方青龙衣胶囊（药制字（2004)Z第0061)，并且经大 量临床病例证明其抗肿瘤疗效确切。该药物具有抗肿瘤、调节免疫、止癌痛、抗转移与化药 协同增效五种疗效。
[0005] 萘醌类成分是北青龙衣中公认的最有效的抗肿瘤成分，胡桃醌为其代表性化合 物。由于北青龙衣中胡桃醌的含量产地差异性大，所以目前利用北青龙衣制备的抗癌药物 质量难以掌控，严重的影响了北青龙衣在临床的使用和治疗效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决目前因产地不同北青龙衣中胡桃醌差异性大，导致利用 北青龙衣制备的抗癌药物质量难以掌控的问题，而提供的一种促使北青龙衣中胡桃酮苷水 解为胡桃酮的方法及胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法。
[0007] 本发明促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法按以下步骤进行：
[0008] 将青龙衣粉末加入甲醇溶液进行超声处理，冷却后滤过，取滤液加入酸性溶液回 流水解，即实现北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃酮。
[0009] 胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法，采用高效液相梯度检测，检测波长为265nm， 进样量为10 μ 1，流速为lml/min ;梯度洗脱条件为初始流动相中甲醇与水的浓度配比为 45ml :55ml，第30~35min流动相中甲醇与水的浓度配比为75ml :25ml，第35min之后流动 相中甲醇与水的浓度配比为45ml :55ml。
[0010] 胡桃酮苷是北青龙衣中另外一种含量较高的萘醌类衍生物，胡桃酮苷在北青龙衣 中以苷和苷元的形式同时存在，胡桃醌与胡桃酮苷水解产物胡桃酮的含量之和在各产地北 青龙衣之间相对稳定，约为2mg/g~2. 5mg/g。因此，本发明方法促使北青龙衣中结合型胡 桃酮苷水解为游离型胡桃酮，使不同产地北青龙衣的抗肿瘤活性主要成分含量达到稳定， 从而保证了北青龙衣抗癌药物的质量和稳定性，使北青龙衣临床使用的安全性和可靠性大 幅提升。
[0011] 由于胡桃醌与胡桃酮的分子式极为接近，分子量也相近，所以其他方法难以将胡 桃醌与胡桃酮加以区分。本发明胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法，不仅能够将胡桃醌与胡 桃酮明确的区别分开，而且可以准确的测定其含量，并具有准确性高的特点。
【附图说明】
[0012] 图1是实施例11中对照品高效液相梯度检测结果图。
[0013] 图2是实施例11中水解液高效液相梯度检测结果图。
【具体实施方式】
[0014] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0015] 一：本实施方式促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法按以 下步骤进行：
[0016] 将青龙衣粉末加入甲醇溶液进行超声处理，自然冷却至室温后滤过，取滤液加入 酸性溶液回流水解，即实现北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃酮。
[0017] 其中，青龙衣粉末与甲醇溶液的比例为0. 5g~3g :25ml ;超声处理时间为40min， 超处理频率为30~70kHZ ;回流温度为70±5°C，回流时间为1±0. 2h。
【具体实施方式】 [0018] 二：本实施方式与一的不同点是：甲醇溶液的浓度为 20%~100%。其它步骤及参数与实施方式一相同。
【具体实施方式】 [0019] 三：本实施方式与一或二的不同点是：滤液与酸性溶 液的体积比为15 :1. 5~14。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。
【具体实施方式】 [0020] 四：本实施方式与一至三之一的不同点是：酸性溶液 的体积浓度为25%。其它步骤及参数与实施方式一至三相同。
【具体实施方式】 [0021] 五：本实施方式与一至四之一的不同点是：酸性溶液 为盐酸或硫酸。其它步骤及参数与实施方式一至四相同。
【具体实施方式】 [0022] 六：本实施方式按以下步骤测定胡桃醌与胡桃酮的含量：采用高效 液相梯度检测，检测波长为265nm，进样量为10 μ 1，流速为lml/min ;梯度洗脱条件为初始 流动相中甲醇与水的浓度配比为45ml :55ml，第30~35min流动相中甲醇与水的浓度配比 为75ml :25ml，第35min之后流动相中甲醇与水的浓度配比为45ml :55ml。
[0023] 实施例1
[0024] 促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法按以下步骤进行：
[0025] 将青龙衣粉末加入甲醇溶液进行超声处理，自然冷却至室温后滤过，取滤液加入 体积浓度为25%的HCl中回流水解，即实现北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃 酮。
[0026] 其中，青龙衣粉末与甲醇溶液的比例为2g :25ml ;甲醇溶液的体积浓度为30% ;超 声处理时间为40min，超处理频率为50kHZ ;回流温度为60°C，回流时间为Ih ;滤液与盐酸 溶液的体积比为15 :7。
[0027] 实施例2
[0028] 本实施例与实施例1的区别点在于甲醇溶液的体积浓度为60%。
[0029] 实施例3
[0030] 本实施例与实施例1的区别点在于甲醇溶液的体积浓度为100%。
[0031] 实施例1~3北青龙衣水解前后胡桃酮、胡桃醌的含量如表1所示。
[0032] 表 1
[0033]
[0034] 实施例4
[0035] 促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法按以下步骤进行：
[0036] 将青龙衣粉末加入甲醇溶液进行超声处理，自然冷却至室温后滤过，取滤液加入 体积浓度为25%的HCl中回流水解，即实现北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃 酮。
[0037] 其中，北青龙衣粉末与甲醇溶液的比例为2g :25ml ;甲醇溶液的体积浓度为60% ; 超声处理时间为40min，超处理频率为40kHZ ;回流温度为60°C，回流时间为Ih ;滤液与盐 酸溶液的体积比为15 :7。
[0038] 实施例5
[0039] 本实施例与实施例4的区别点在于取滤液加入0. 2mol/L NaOH溶液中回流水解； 滤液与NaOH溶液的体积比为15 :7。
[0040] 实施例6
[0041] 本实施例与实施例4的区别点在于滤液挥干后加入酶液中60°C水解30min，之后 沸水灭活；Ig α -淀粉酶加入50ml pH值6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中配置成本实 施例酶液；滤液与酶液的体积比为15 :7。
[0042] 实施例4~6北青龙衣水解前后胡桃酮、胡桃醌的含量如表2所示。
[0043] 表 2
[0044]
酸性条件下水解能够增加胡桃酮的含量，碱性条件下水解胡桃醌、胡桃酮含量均显著 降低，而酶水解对二者含量均无影响。
[0045] 实施例7
[0046] 本实施例与实施例4的区别点在于取滤液加入体积浓度为25%的H2S04溶液中回 流水解；滤液与H2S04溶液的体积比为15 :7。
[0047] 实施例4和7北青龙衣水解前后胡桃酮、胡桃醌的含量如表3所示。
[0048] 表 3
[0049]
[0050