氮气浓缩至〇. 5-0. 8ml，再以甲醇定容至Iml，经0. 45 μ m微孔滤膜 过滤待测； (4) 参照物溶液的制备：精密称取二烯丙基二硫醚30. 44 mg和二烯丙基三硫醚32. 12 mg，溶于甲醇中定容至50ml，再吸取上述混合溶液Iml用甲醇定容至10ml，作为参照物； (5) 高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18,5 ym，4.6x250mm;保护柱为： Eclipse Plus C18 Grd，5 μ m，4.6x12. 5mm;柱温 35°C;流动相为甲醇和 0.2% 甲酸水溶液； 采用梯度淋洗方式 〇 - 2 min - 10 min - 20 min，甲醇：70% - 70% - 80% - 80% ;二极管 阵列检测器检测波长240nm ;进样量50 μ L ;在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜酶解 产物HPLC指纹图谱。
[0018] (6)重复上述（1)至（5)，使用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价 系统2004版》软件对10批次宝坻"六瓣红"大蒜酶解产物HPLC指纹图谱进行分析，确定 了 14个共有特征峰，见图3,其保留时间分别为：2. 243 min、2. 991 min、3. 423 min、3. 871 min、4. 731 min、5.993 min、6. 629 min、7. 168 min、8. 151 min、9. 295 min、10. 824 min、 13. 344 min、15. 65 min、18. 723 min，相对标准偏差（RSDK2%，这些共有特征峰构成了宝坻 "六瓣红"大蒜酶解产物HPLC标准指纹图谱，见图3。
[0019] 表1提供的是《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件相似度计算结果， 各样品与对照指纹图谱的相似度均达到〇. 99以上，说明本发明确定的宝坻"六瓣红"大蒜 酶解产物HPLC标准指纹图谱是准确的。
[0020] 表1各批次宝坻"六瓣红"大蒜酶解产物HPLC指纹图谱相似度计算结果
实施例3 : 宝坻产和非宝坻产"六瓣红"大蒜及其他品种大蒜进行色谱分析，该方法步骤如下： (1) 样品、试剂盒仪器：宝坻产"六瓣红"大蒜，非宝坻产"六瓣红"大蒜，新疆白皮大蒜， 使用安捷伦1200型高效液相色谱仪，试剂均为色谱纯或分析纯； (2) 大蒜酶解产物待测溶液的制备：分别称取各品种大蒜鳞茎20g破碎、研磨，加 25-30ml蒸馏水，50-55°C温浴酶解lh，加甲醇定容至50ml，5000 X g离心15min，取上清液经 0. 45 μ m微孔滤膜过滤； (3) 大蒜酶解产物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、IOml超纯水活化， 平衡15min ;待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲 醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至〇. 5-0. 8ml，再以甲醇定容至Iml，经0. 45 μ m微孔滤膜 过滤待测； (4) 参照物溶液的制备：精密称取二烯丙基二硫醚30. 44 mg和二烯丙基三硫醚32. 12 mg，溶于甲醇中定容至50ml，再吸取上述混合溶液Iml用甲醇定容至10ml，作为参照物； (5) 高效液相色谱分析：色谱柱为：Eclipse Plus C18,5 ym，4.6x250mm;保护柱为： Eclipse Plus C18 Grd，5 μ m，4.6x12. 5mm;柱温 35°C;流动相为甲醇和 0.2% 甲酸水溶液； 采用梯度淋洗方式 〇 - 2 min - 10 min - 20 min，甲醇：70% - 70% - 80% - 80% ;二极管 阵列检测器检测波长240nm ;进样量50 μ L ;在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜酶解 产物HPLC指纹图谱。
[0021] 分别精密吸取供试品液溶液，在上述色谱条件下经高效液相色谱仪分离检测，得 到相应大蒜样品的HPLC指纹图谱。
[0022] 表2提供的是《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》软件相似度计算结果， 其中Sl为宝坻"六瓣红"大蒜标准指纹图谱，S2、S3宝坻产"六瓣红"大蒜，S4、S5为新疆 白皮大蒜，S6、S7为非宝坻产"六瓣红"大蒜。由计算结果可以看出，宝坻"六瓣红"大蒜与 标准指纹图谱相似度最高，为〇. 999,说明质量稳定。而新疆白皮大蒜与标准指纹图谱相似 度最低，为〇. 985和0. 986,非宝坻产"六瓣红"大蒜与标准指纹图谱相似度也均低于宝坻产 地品种，说明利用该方法可以有效进行宝坻"六瓣红"大蒜的真伪及产地鉴别，并能全面、准 确地评价其内在品质质量；
【主权项】
1. 一种六瓣红大蒜酶解产物HPLC指纹图谱的构建方法，其特征在于按如下的步骤进 行： (1) 大蒜酶解产物待测溶液的制备：称取六瓣红大蒜鳞茎20g破碎、研磨，加25-30ml蒸 馏水，50-55°C温浴酶解lh，加甲醇定容至50ml，5000Xg离心15min，取上清液经0. 45ym 微孔滤膜过滤； (2) 大蒜酶解产物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、IOml超纯水活化， 平衡15min;待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；再由5ml甲 醇洗脱后，室温下低流速氮气浓缩至〇. 5-0. 8ml，再以甲醇定容至lml，经0. 45ym微孔滤 膜过滤待测； (3) 参照物溶液的制备：精密称取二烯丙基二硫醚30. 44mg和二烯丙基三硫醚32. 12 mg，溶于甲醇中定容至50ml，再吸取上述混合溶液Iml用甲醇定容至10ml，作为参照物； (4) 高效液相色谱分析：色谱柱为：EclipsePlusC18,5ym，4.6x250mm;保护柱为： EclipsePlusC18Grd，5ym，4. 6x12. 5mm;柱温 35°C;流动相为甲醇和 0.2% 甲酸水溶液； 采用梯度淋洗方式 〇 - 2min- 10min- 20min，甲醇：70% - 70% - 80% - 80% ;二极管 阵列检测器检测波长240nm;进样量50yL;在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜酶解 产物HPLC指纹图谱； (5) 重复上述（1)至（4)，对10批次六瓣红大蒜酶解产物建立HPLC指纹图谱，通过比较 分析确定了 14个共有特征峰，其保留时间分别为：2. 243min、2. 991min、3. 423min、3. 871 min、4. 731min、5.993min、6.629min、7. 168min、8. 151min、9.295min、10.824min、 13. 344min、15. 65min、18. 723min，相对标准偏差（RSDK2%，这些共有特征峰构成了六瓣 红大蒜酶解产物HPLC标准指纹图谱。2. -种六瓣红大蒜品种鉴别和生产质量控制方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 大蒜酶解产物待测溶液的制备：称取待测大蒜鳞茎20g破碎、研磨，加25-30ml蒸馏 水，50-55°C温浴酶解lh，加甲醇定容至50ml，5000Xg离心15min，取上清液经0. 45ym微 孔滤膜过滤； (2) 大蒜酶解产物供试品溶液的制备：C18固相萃取小柱经5ml甲醇、IOml超纯水活化； 待测溶液以4ml/min速度过柱，再用5ml超纯水淋洗，低真空抽干；5ml甲醇洗脱后室温下 低流速氮气浓缩至0. 5-0. 8ml，再以甲醇定容至Iml，经0. 45ym微孔滤膜过滤待测； (3) 参照物溶液的制备：称取二烯丙基二硫醚30. 44mg和二烯丙基三硫醚32. 12mg， 溶于甲醇中定容至50ml，再吸取上述混合溶液Iml用甲醇定容至10ml，作为参照物； (4) 高效液相色谱分析：色谱柱为：EclipsePlusC18,5ym，4.6x250mm;保护柱为： EclipsePlusC18Grd，5ym，4. 6x12. 5mm;柱温 35°C;流动相为甲醇和 0.2% 甲酸水溶液； 采用梯度淋洗方式 〇 - 2min- 10min- 20min，甲醇：70% - 70% - 80% - 80% ;二极管 阵列检测器检测波长240nm;进样量50yL;在上述条件下分析供试品溶液，得到大蒜酶解 产物HPLC色谱图； (5) 将步骤（4)，得到的大蒜HPLC色谱图与"六瓣红"大蒜酶解产物HPLC标准指纹图谱 进行对比，通过对其所含化学成分差异的分析鉴别大蒜品种、产地或品质质量。
【专利摘要】本发明公开了一种宝坻“六瓣红”大蒜酶解产物HPLC指纹图谱的建立方法，具体步骤为将宝坻特有品种“六瓣红”大蒜鳞茎经固相萃取等步骤制备成供试品溶液，在一定条件下进行高效液相色谱分析检测，获得“六瓣红”大蒜酶解产物的HPLC指纹图谱。通过对10批次样品的HPLC指纹图谱分析，确定共有特征峰，得到标准指纹图谱。该标准指纹图谱能够为“六瓣红”大蒜的品种及产地鉴别和生产质量控制提供可靠的依据。本发明操作便捷，稳定性高，特异性强，重现性好，特征峰较多，分析效率高，利用本发明将能对“六瓣红”大蒜进行真伪及产地鉴别，并能全面、准确、有效的评价其内在品质质量。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/06
【公开号】CN105181838
【申请号】CN201510557809
【发明人】王振英, 尚云涛, 任春雪, 范宝莉, 刘晓颖, 党光, 彭永康, 陈宏 , 王中良
【申请人】天津师范大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年9月6日