一种多肽固相合成的监测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽固相合成领域，具体涉及一种多肽固相合成的监测方法，尤其是 涉及一种Fmoc策略的多肽固相合成中反应完成情况的监测方法。
【背景技术】
[0002] 多肽固相合成技术是由R.B.Merrifield于1963年发明的一项技术，它是将氨基 酸的C末端固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次缩合氨基酸，延长肽链、合成蛋白质 的固相合成法。在固相法中，每步反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的。克服 了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为自动化合成肽奠定了基础。为此， Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖。自Merrifield创立并发展了固相合成多肽的方 法，使多肽合成领域取得了重大突破，对化学、生化、医药、免疫及分子微生物学等领域也都 起了巨大的推动作用。随着对连接分子、脱除方法和保护基的不断研究，以及新型树脂的开 发，近年来固相方法在多肽合成上的应用更是发展迅速。利用这一方法几乎能够高收率地 制备任何多肽。
[0003] 1978 年，changMeienlofer和Atherton等人米用Carpino报道的Fmoc(9-荷甲氧 羰基）作为α氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用弱碱性试剂如哌啶等脱去。与Boc 策略的固相合成法相比，Fmoc策略的固相合成法具有反应温和、副反应及副产物少、操作简 便等特点。近年来，Fmoc合成法得到了广泛的应用。
[0004] 在现有的技术中，Fmoc策略固相合成法是通过以茚三酮显色法来监测的反应完成 情况的：树脂上连接的氨基酸上的Fmoc保护基团以哌啶等试剂脱去后，氨基暴露出来，可 与茚三酮发生显色反应；而脱保护后的氨基酸的氨基与被Fmoc保护的氨基酸缩合反应完 全后，没有暴露的氨基，以茚三酮显色反应检测不显色。
[0005] 茚三酮显色法虽然可以监测反应完成情况，但存在技术粗糙、结果不准确、存在观 察差异、假阳性和假阴性率高等问题。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有监测方法中存在的问题，本发明提供了一种多肽固相合成的监测方 法。
[0007] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种多肽固相合成的监测方法，以高效液相色谱法对脱保护反应的反应液中的反 应产物进行检测，确定多肽固相合成脱保护步骤完成情况；和/或以高效液相色谱法对氨 基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的含量进行检测，确定氨基酸缩合反应的完成情况。
[0009] 多肽固相合成的反应包括脱保护步骤和氨基酸缩合步骤。
[0010] 在一些实施方案中，在多肽固相合成的反应中对多肽固相合成的脱保护步骤进行 监测，以高效液相色谱法对脱保护反应的反应液中的反应产物进行检测，确定多肽固相合 成脱保护步骤完成情况。 toon] 在本发明所述监测方法中，以高效液相色谱法对脱保护反应的反应液中的反应产 物进行检测，若脱保护反应的反应液中检测不到反应产物和/或反应产物的产生量与树脂 的载量一致，则说明反应已经完全。
[0012] 其中，优选的，所述多肽固相合成的反应中的所述脱保护反应为以脱保护试剂对 连接在树脂上的Fmoc保护基团进行脱保护。
[0013] 本发明所述监测方法中，以脱保护试剂进行脱保护，所述脱保护试剂为哌啶、哌 嗪、二乙胺中至少一种。
[0014] 本发明所述监测方法中，所述脱保护次数至少为一次。优选为两次或两次以上。
[0015] 在一些实施方案中，多肽固相合成的反应中所述脱保护试剂为哌啶，本发明所 述监测方法采用Fmoc-Piperidine作为对照品，高效液相色谱法检测脱保护反应的反 应液中Fmoc-Piperidine的浓度，进而通过检测二次脱保护反应的反应液中是否存在 Fmoc-Piperidine判断脱保护反应的完成情况。
[0016] 优选的，所述高效液相色谱法检测脱保护反应的反应液中Fmoc-Piperidine的浓 度的色谱条件为以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以0. 1%TFA-水溶液为流动相A相， 0. 1%TFA-乙腈溶液为流动相B相，流速为1.OmL/min，25°C，检测波长为220nm，梯度洗脱。
[0017] 更优选的，所述高效液相色谱法检测的洗脱程序为B相初始浓度为50%，0min~ 20min，50 %线性变化至 100 % ;20min~20.lmin，100 %线性变化至 50 %。
[0018] 在另一些实施方案中，多肽固相合成的反应中所述脱保护试剂为哌嗪、二乙胺中 至少一种或哌啶与其他脱保护试剂的混合物，本发明所述监测方法通过检测二次脱保护反 应的反应液中是否存在对应的反应产物判断脱保护反应的完成情况。
[0019] 本发明所述监测方法不仅可以用于多肽固相合成的反应中脱保护步骤的监测，还 可以用于氨基酸缩合步骤的监测。
[0020] 在一些实施方案中，在多肽固相合成的反应中对多肽固相合成的氨基酸缩合步骤 进行监测，以高效液相色谱法对氨基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的含量进行检测， 确定氨基酸缩合反应的完成情况。
[0021] 在本发明所述监测方法中，以高效液相色谱法对氨基酸缩合反应的反应液中保护 氨基酸的含量进行检测，若氨基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的减少量与树脂的载量 值一致且浓度不再降低时，则说明反应已经完全。
[0022] 其中，优选的，所述氨基酸缩合反应中所述保护氨基酸为Fmoc保护的任意一种氨 基酸或氨基酸类似物。
[0023] 在一些实施方案中，本发明所述监测方法对多肽固相合成的氨基酸缩合步骤进行 监测，所述高效液相色谱法具体为以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以〇. 1%TFA-水溶 液为流动相A相，0. 1 %TFA-乙腈溶液为流动相B相，流速为1.OmL/min，30~35°C，检测波 长为220nm，梯度洗脱。
[0024] 更优选的，所述高效液相色谱法检测的洗脱程序为B相初始浓度为10%，0min~ 30111；[11，10%线性变化至100%;30111；[11~40111；[1111，维持100%不变；40111；[11~40.1111；[11，100% 线性变化至10%。
[0025] 有上述技术方案可知，本发明提供了一种多肽固相合成的监测方法，以高效液相 色谱法对脱保护反应的反应液中的反应产物进行检测，确定多肽固相合成脱保护步骤完成 情况；和/或以高效液相色谱法对氨基酸缩合反应的反应液中保护氨基酸的含量进行检 测，确定氨基酸缩合反应的完成情况。本发明所述多肽固相合成的监测方法可对多肽固相 合成中脱保护和氨基酸缩合反应的完成情况进行监测，有效判断反应完成情况及实验终 点。与传统的茚三酮显色法相比，本发明所述监测方法具有可量化、结果准确度高的特点， 利于对多肽产品中缺失肽等工艺杂质进行监控，确保多肽类合成产品的质量。
【附图说明】
[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0027] 图1示实施例1高效液相色谱法检测Fmoc-Piperidine的线性结果图，其中横坐 标为样品浓度，纵坐标为峰面积。
【具体实施方式】
[0028] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0029] 下面将结合具体实施例对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这 些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的保护范围。本发明中用到的树脂、保护氨 基酸均购自吉尔生化有限公司。说明书和权利要求书中所使用的英文及英文缩写的含义列 于下表中。
[0030]
[0031]
[0032] 实施例1:
[0033] 取Fmoc-Piperidine对照品，以DMF配制成一系列浓度的溶液并以高效液相法进 行检测。
[0034] 高效液相色谱方法如下：
[0035]色谱柱：WatersXbridgeC18, 3. 5μm，4. 6x250mm;
[0036]柱温：25Γ;
[0037]流速：lmL/min；
[0038]检测波长：220nm;
[0039]流动相：0·1%TFAinΗ20(Α)，0·1%TFAinacetonitrile(B)，洗脱程序如表 1〇
[0040] 表1洗脱程序
[0041]
[0042] 高效液相色谱法检测Fmoc-Piperidine的线性结果如图1所示。
[0043] 由图1可知，本发明所述高效液相色谱法用于检测Fmoc-Piperidine线性良好。
[0044] 实施例2:
[0045] 取载量为0.3mmol/gMBHAResinlg，以哌啶：DMF= 1:4(V/V)进行脱保护两次， 分别收集两次的脱保护液，以实施例1所述高效液相色谱法检测其中Fmoc-Piperidine的 含量。检测结果如表2。
[0046] 表2高效液相色谱法检测其中Fmoc-Piperidine的含量
[0047]
[0048] 从上述结果可知，第一次脱保护实验产生的Fmoc-Piperidine与树脂上的Fmoc基 团数目一致，第二次脱保护实验中未检出Fmoc-Piperidine，即可证明反应在已经完全。
[0049] 实施例3:
[0050] 取实施例2中完成脱保护的树脂，加入0· 7g的Fmoc-Lys(Boc) -0H、0. 57g的HBTU、 0. 6mlN-甲基吗啉以及lOmLDMF，混合均匀并于室温下振摇反应30分钟，收集得反应液1， 并取少量树脂以茚三酮显色法检测反应情况；重复上述反应步骤，收集得反应液2,并取少 量树脂再次以茚三酮显色法检测反应情况。另取〇. 7g的Fmoc-Lys(Boc)-0H、0. 57g的HBTU、 0. 6mlN-甲基吗啉以及10mlDMF混合后作为对照溶液，以高效液相色谱法检测反应液1和 反应液2中的Fmoc-Lys(Boc) -0H浓度。检测方法如下：
[0051]色谱柱：WatersXbridgeC18, 3. 5μm，4. 6x250mm;
[0052]柱温：30Γ;
[0053]流速：lmL/min；
[0054] 检测波长