阿普斯特中3-乙酰氨基邻苯二甲酸的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及阿普斯特中杂质的检测方法，具体涉及3-乙酰氨基邻苯二甲酸的检 测方法。
【背景技术】
[0002] 阿普斯特（apremilast，（S)-2-[l_(3-乙氧基-4-甲氧基苯基）-2_甲磺酰基乙 基]-4-乙酰基氨基异吲哚啉-1，3-二酮，分子式：C22H24N207S，分子量：460. 5)是由美国 Celgene生物技术公司开发，2014年3月21日经美国食品药品监督管理局（FDA)批准用于 成人活跃型银肩病性关节炎（PsA)的治疗，商品名为Otezla。
[0003]
[0004] 在阿普斯特产品中，往往会存在有多种杂质，例如其R构型对映异构体、3-氨基邻 苯二甲酸、3-乙酰氨基邻苯二甲酸以及其他各种中间体和降解产物。
[0005] 由于杂质的存在会严重影响药物的质量控制和用药安全，因此需要对药物中各种 杂质的含量进行检测和监控。
[0006] 因此，为解决上述问题，已有多篇文献报道了（例如中国专利CN104458961A、 CN104792913A、CN105136933A、CN104820028A)阿普斯特中R构型对映异构体杂质的检测方 法。然而，对于阿普斯特中的3-乙酰氨基邻苯二甲酸，目前尚没有相关检测方法的报道。
【发明内容】
[0007] 为解决上述问题，本发明提供了一种阿普斯特中3-乙酰氨基邻苯二甲酸的检测 方法，其特征在于：它包括以下步骤：
[0008]a、制备供试品溶液：
[0009] 取待测阿普斯特样品，流动相溶解，过滤或不过滤，制备得到供试品溶液；
[0010] b、制备3-乙酰氨基邻苯二甲酸的对照品溶液：
[0011] 取3-乙酰氨基邻苯二甲酸对照品，流动相溶解，制备得到3-乙酰氨基邻苯二甲酸 的对照品洛液；
[0012] c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：
[0013] 色谱柱：亲水作用色谱柱；
[0014] 流动相：乙腈-0· 02mol/L磷酸二氢盐溶液或甲醇-0· 02mol/L磷酸二氢盐溶液； 所述磷酸二氢盐溶液选自磷酸二氢钠溶液或磷酸二氢钾溶液；
[0015] 检测波长：230±10nm，优选的检测波长为230±2nm;
[0016] d、根据检测结果计算得到阿普斯特样品中3-乙酰氨基邻苯二甲酸的含量。
[0017] 进一步地，步骤c中，所述亲水作用色谱柱是以酰胺键合的硅胶为填充剂的色谱 柱。更进一步地，所述酰胺键合的硅胶是丙烯酰胺键合的硅胶。更进一步地，步骤c中，所 述色谱柱的规格为：内径4. 6mm，长度250mm，填料粒径5μm。更进一步地，步骤c中，所述 色谱柱的型号为VenusilHILIC100A。。
[0018] 进一步地，步骤c中，所述甲醇或乙腈与磷酸二氢盐溶液的体积比为80% :20%~ 90% :10%〇
[0019] 更进一步地，步骤c中，所述流动相为下述体积比的混合溶液：
[0020] 乙腈-0· 02mol/L磷酸二氢钾溶液=80 :20、乙腈-0· 02mol/L磷酸二氢钾溶液= 85 :15、乙腈-0· 02mol/L磷酸二氢钾溶液=90 :10、甲醇-0· 02mol/L磷酸二氢钾溶液=80 : 20、甲醇-0· 02mol/L磷酸二氢钾溶液=85 :15、甲醇-0· 02mol/L磷酸二氢钾溶液=90 :10、 乙腈-0. 02mol/L磷酸二氢钠溶液=80 :20、乙腈-0. 02mol/L磷酸二氢钠溶液=85 :15或 乙腈-0· 02mol/L磷酸二氢钠溶液=90 :10〇
[0021] 进一步地，步骤c中，所述色谱条件的柱温为30°C~40°C，流速为0. 8mL/min~ 1. 2mL/min〇
[0022] 进一步地，步骤c中，所述色谱条件的柱温为30°C~35°C，流速为.8mL/min~ 1. 0mL/min〇
[0023] 进一步地，其特征在于：步骤c中，所述色谱条件的进样量为20μL。
[0024] 亲水作用色谱柱指的是适用于亲水作用色谱（hydrophilicinteractionliquid chromatography，HILIC)的色谱柱。HILIC是采用极性固定相和水-水溶性有机溶剂D- 种新型色谱分离手段，HILIC可以克服正相色谱和反相色谱在极性化合物分离过程中的不 足，往往能够提供与反相色谱截然不同的分离选择性。发明人也在色谱柱的筛选中也发现， 反相色谱并不能准确检测出阿普斯特中的3-乙酰氨基邻苯二甲酸。
[0025] 在硅胶基质的亲水作用色谱固定相中，根据其材料，主要分为未衍生化硅胶型、氨 基型、氰基型、二醇基型、酰胺型、聚（琥珀酰亚胺）型、糖型和两性离子型键合相型。在本 发明具体的实施例中，采用的是酰胺型的色谱柱。通常情况下，相比氨基柱，酰胺柱具有更 好的稳定性。
[0026] 经试验证明，本发明阿普斯特中3-乙酰氨基邻苯二甲酸的检测方法，采用的是酰 胺型的亲水作用色谱柱，有效将阿普斯特中3-乙酰氨基邻苯二甲酸分离检测出来，检测结 果准确、可靠，并且具有线性关系优异、精密度高、稳定性好、重复性好、回收率好、操作简便 等诸多优点，适合于推广应用。
[0027] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0028] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0029] 图1为实施例1本发明方法对系统适用性试验的检测结果；
[0030] 图2为实施例1对比试验方法对混合溶液的检测结果；
[0031] 图3为实施例13的标准曲线图；
[0032] 图4-6为实施例13专属性试验的检测结果：图4为（a)供试品溶液；图5为（b) 对照品溶液；图6为（c)溶剂空白溶液。
【具体实施方式】
[0033] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0034] 高效液相色谱仪（型号：LC_20AT二元栗，生产厂家：日本岛津公司）。
[0035] 电子天平（型号：AUW220D，生产厂家：日本岛津公司）。
[0036] 阿普斯特（批号：Y150102,来源：成都百裕金阁莱药业有限公司）。
[0037] 阿普斯特对照品（批号：Υ150101，来源：成都百裕金阁莱药业有限公司）。
[0038] 3-乙酰氨基邻苯二甲酸对照品（批号：ΑΡ-Ι，来源：成都百裕金阁莱药业有限公 司）。
[0039] 实施例1
[0040] 1、检测波长的确定
[0041] 精密称取阿普斯特适量，用流动相（乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾=85 :15)配制 成浓度为20μg/mL的溶液，作为供试品溶液。
[0042] 精密称取对照品（3-乙酰氨基邻苯二甲酸）适量，用流动相（乙腈-0.02mol/L磷 酸二氢钾=85 :15)配制成浓度为20μg/mL的溶液，作为对照品溶液。
[0043] 取上述的供试品溶液、对照品溶液，在200nm~400nm波长范围内进行扫描，试验 结果见表1。
[0044] 表1、本发明的紫外扫描结果
[0045]
[0046] 试验结果表明，检测波长在220nm~230nm范围内，均适合本发明的高效液相色谱 检测方法；优选的，检测波长为230±2nm。
[0047]2、系统适用性试验
[0048] 制备供试品溶液：称取阿普斯特25mg，置于50mL量瓶中，加流动相（乙 腈-0. 02mol/L磷酸二氢钾=85:15)适量，振摇10分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为 供试品溶液。
[0049] 制备对照品溶液：称取3-乙酰氨基邻苯二甲酸对照品5mg，置于100mL量瓶中，精 密量取lmL，置于lOOmL量瓶中，加流动相（乙腈-0. 02mol/L磷酸二氢钾=85 :15)稀释至 刻度，摇匀，作为对照品溶液。
[0050] 采用亲水作用色谱进行检测：
[0051] 色谱柱的填充剂：用丙烯酰胺键合的硅胶为填充剂；
[0052]色谱柱的型号为Venusil HILIC 100A。，规格为：内径为4.6mm，长度为250mm，填 充剂粒径为5μm;
[0053] 流动相：乙腈-0·02mol/L磷酸二氢钾（体积比为85:15);
[0054]柱温：35°C ;
[0055]流速：1.OmL/min；
[0056]检测波长：230nm ;
[0057]进样量：20μL。
[0058] 系统适用性试验：取阿普斯特0. 5mg、3-乙酰氨基邻苯二甲酸对照品0. 5μg，加入 lmL流动相（乙腈-0. 02mol/L磷酸二氢钾=85:15)，作为系统适用性溶液；量取20μL系 统适用性溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，阿普斯特与3-乙酰氨基邻苯二甲酸之间的分 离度应不低于2. 0,理论塔板数按阿普斯特峰计算应不小于2000。
[0059] 系统适用性试验的检测结果见图1，阿普斯特（保留时间为3. 038min)与3-乙酰 氨基邻苯二甲酸对照品（保留时间为6. 469min)之间的分离度为10. 782,理论塔板数（按 3-乙酰氨基邻苯二甲酸色谱峰计算）为8891，本发明亲水作用色谱可以用于检测阿普斯特 中3-乙酰氨基邻苯二甲酸的含量
[0060] 3、高效液相色谱检测方法
[0061] 制备供试品溶液：称取阿普斯特25mg，置于50mL量瓶中，加流动相（乙 腈-0. 02mol/L磷酸二氢钾=85 :15)适量，振摇10分钟，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为 供试品溶液。
[0062] 制备对照品溶液：称取3-乙酰氨基邻苯二甲酸对照品5mg，置于lOOmL量瓶中，精 密量取lmL，置于lOOmL量瓶中，加流动相（乙腈-0. 02mol/L磷酸二氢钾=85 :15)稀释至 刻度，摇匀，作为对照品溶液。
[0063] 分别将供试品溶液和对照品溶