一种检测动物组织中兽药残留量的前处理方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药物分析学领域，涉及一种检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，本方法可用于排除动物组织中复杂内源物质的干扰并有效富集微量兽药残余。
【背景技术】
[0002]随着科技和医学的发展，动物源食品中兽药残余对人体的危害已经逐渐被人们所认知并引起了社会的关注，据报道，中国及欧盟已禁止了饲料中的违法添加行为并出台了一些列相关规定。然而，在具体进行检测时却因动物组织本身的复杂性、严重的基质效应及对极微量的兽药残余缺少有效的富集方法等，使得研究遇到重重瓶颈，而且其极低的含量给后续的分析带来困难，限制了人们对食品安全的控制。
[0003]现有技术公开的研究报导中多仅采用简单的蛋白沉淀、液液萃取或固相萃取等的方法，随着兽药残留种类的不断增加，多级色谱-质谱联用(GC-MS/MS，LC-MS/MS)越来越多地被用作分析检测的手段，以便能够同时分析检测物质，但是更高的灵敏度对样品的前处理要求更高，这对目前的分析前处理技术和手段是一个严峻的挑战，有研究尝试为了加速实现完全的萃取，考虑使用微波辅助提取和红外加速溶剂提取等装置和技术。
[0004]石墨稀(graphene)是近年被发现和合成的一种新型二维平面碳质纳米材料。石墨烯表现出许多优异的性质，具有极高的比表面积、良好的导热性和室温下高速的电子迀移率，具有较低的生产成本(相对于碳纳米管)，同时含有丰富的31共轭体系，因此具有极佳的吸附性能。石墨烯由于这些优异性能，已经成为纳米材料领域的一大研究热点。
[0005]鉴于现有技术的状况，本申请的发明人拟提供一种检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，使其更有效的用于排除动物组织中复杂内源物质的干扰并有效富集微量兽药残余。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于为解决现有技术存在的动物组织中兽药残留分析工作中遇到的基质效应影响过大、无法对微量兽药进行有效富集等问题，提供一种检测动物组织中兽药残留量的前处理方法。本发明方法能有效排除蛋白质等生物大分子的干扰，能够对极微量的兽药成分进行富集。
[0007]本发明方法中将微波辅助或红外与纳米材料结合起来，既能解决时间过长，过程繁琐的问题，又可以利用纳米材料作为吸附剂的优点既具有介孔分子筛的超大比表面积、有序的孔径大小和独特的修饰基团，使能进入其孔道中并通过兽药残留与烷基间的疏水作用力结合，同时大分子的蛋白质排斥在孔道外，从而能够对复杂的生物样品中的农残药物进行有效富集，从而简化痕量兽药残留的分析困难，为复合纳米材料的应用提供新的途径。
[0008]具体的，本发明提供的一种检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，包括以下步骤:
[0009]I)溶液配制:配制磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、β -葡萄糖醛酸酶溶液；将动物组织粉碎匀浆化处理后加入适量缓冲液调节至弱酸性；
[0010]2)酶解孵育:向组织匀浆中加入足量β-葡萄糖醛酸酶溶液或罗曼蜗牛(Helixpomatia)组织液，恒温水浴或红外辅助微波处理；
[0011]3)后续处理:将孵育后所得溶液离心后取上清液，以乙酸乙酯洗涤沉淀并离心收集乙酸乙酯与上清液合并。所得溶液室温下旋转蒸发除去溶剂，剩余物用少量乙醇复溶，再将得到的样品基质以一种功能化复合材料处理，本发明的实施例中采用烷基修饰的石墨烯介孔娃复合材料。
[0012]本发明所述方法中，
[0013]I)磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液浓度为0.01-0.1Μ.；
[0014]2)组织匀浆以缓冲液调节至pH = 1-5左右；
[0015]3)酶解孵育步骤中恒温水浴或者红外、微波控温应保证温度在40_60°C左右保持恒定；微波功率在200-600W的范围内；
[0016]4)酶解孵育步骤的孵育时间为0.1-640分钟的范围内；
[0017]5)离心处理步骤中，离心速率为6000-10000rpm，离心时间为5-20分钟；
[0018]6)以有机溶剂洗涤沉淀的步骤中，有机溶剂与沉淀的体积比为5:1-1:1 ;共洗涤2次；
[0019]7)复溶所用的有机溶剂体积不宜多，保证复溶后溶液澄清透明即可；必要时可超声处理使其充分溶解。
[0020]本发明进行了动物肝脏中糖皮质激素类药物残留检测方法的前处理，结果显示，本方法能有效富集动物组织中的微量兽药残余，方便进行后续的检测步骤；本发明的方法简便易操作，耗时短，成本低，设备低廉，本发明方法可以适用于所有动物组织。
[0021]本发明的方法对比现有的动物组织前处理技术具有以下优点:
[0022]I)不局限于传统的简单液液萃取，而是对组织充分粉碎匀浆后进行彻底的酶解，不仅使动物组织达到了机械粉碎无法完成的彻底消化，也使部分与生物大分子结合的药物游离出来，有利于提高后续检测的准确性；
[0023]2)优化了酶解组织的最佳条件，包括温度、pH及孵育时间，提出对于孵育温度的控制可采用恒温水浴、微波处理或红外控温等方式；
[0024]3)采用有机溶剂反复洗涤沉淀，保证动物组织中的残留药物被充分提取；
[0025]4)旋转蒸发除去溶剂后以少量有机溶剂复溶，浓缩了药物浓度，有利于后续质谱分析。
【附图说明】
[0026]图1为本发明方法操作流程图。
[0027]图2为实施例中猪肝中糖皮质激素残留的前处理方法的技术流程图。
[0028]图3为实施例中微波辅助酶解，纳米复合材料为吸附剂富集猪肝中地塞米松、倍他米松和泼尼松龙的色谱图。
【具体实施方式】
[0029]下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
[0030]实施例1 一种动物肝脏中糖皮质激素类药物残留检测方法的前处理方法
[0031 ] 烷基修饰的石墨烯介孔硅复合材料分散到50%的甲醇中，配成10mg/mL的分散液待用；
[0032]将5g新鲜猪肝粉碎成组织匀浆，加入1mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液调节pH至5.2，加入100 μ L 160KU/mL的β -葡萄糖醛酸酶溶液及50 μ L0.2ng/mL的氢化可的松溶液，于40°C恒温水浴保温4小时或微波(600W)辅助酶解0.5min或红外辅助酶解(400W)0.5h ；
[0033]孵育后所得溶液以8000rpm离心15分钟，，取上清液液，以1mL乙酸乙酯洗涤沉淀，洗涤两次后将离心收集的乙酸乙酯与上清液合并；所得溶液室温下旋转蒸发除去溶剂，剩余物用乙醇复溶使成2mL溶液。再将得到的样品基质以CS烷基修饰的石墨烯介孔硅复合材料处理后进样HPLC-MS/MS (高效液相串联质谱)分析检测，结果显示，本方法能有效富集动物组织中的微量兽药残余，方便进行后续的检测步骤；本发明的方法简便易操作，耗时短，成本低，设备低廉。
【主权项】
1.一种检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，其特征在于，其包括步骤: 1)溶液配制:配制磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液、β-葡萄糖醛酸酶溶液；将动物组织粉碎匀浆化处理后加入适量缓冲液调节至弱酸性； 2)酶解孵育:向组织匀浆中加入足量葡萄糖醛酸酶溶液或罗曼蜗牛(Helixpomatia)组织液，恒温水浴或红外辅助微波处理； 3)后续处理:将孵育后所得溶液离心后取上清液，以乙酸乙酯洗涤沉淀并离心收集乙酸乙酯与上清液合并。所得溶液室温下旋转蒸发除去溶剂，剩余物用少量乙醇复溶，再将得到的样品基质以一种功能化复合材料处理。2.根据权利要求1所述的检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，其特征在于:所述的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液浓度为0.01-0.1M。3.根据权利要求1所述的检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，其特征在于:组所述的织匀浆以缓冲液调节至PH = 5-9ο4.根据权利要求1所述的检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，其特征在于:所述的酶解孵育步骤中恒温水浴或者红外、微波控温应保证温度在40°C -60°C ;微波功率在200-600W的范围内。5.根据权利要求1所述的检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，其特征在于:所述的恒温水浴或者红外、微波控温酶解孵育步骤的孵育时间为0.1-640分钟的范围内。6.根据权利要求1所述的检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，其特征在于:所述的离心处理步骤中，离心速率为4000-8000rpm，离心时间为10-20分钟。7.根据权利要求1所述的检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，其特征在于:所述的有机溶剂洗涤沉淀的步骤中，有机溶剂与沉淀的体积比为5:1-1:1 ;洗涤2-6次。8.根据权利要求1所述的检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，其特征在于:所述的复溶所用的有机溶剂体积以复溶后溶液澄清透明为准。9.根据权利要求1所述的检测动物组织中兽药残留量的前处理方法，其特征在于:所述的一种功能化复合材料选自烷基修饰的石墨烯介孔硅复合材料。
【专利摘要】本发明属分析化学领域，涉及一种检测动物组织中兽药残留量的前处理方法。本发明方法中包括，向匀浆化的动物组织中加入适量缓冲液调节pH至弱酸性，加入足量酶解液，而后恒温水浴或红外辅助微波处理酶解孵育，将孵育后所得溶液离心后取上清液，以有机溶剂洗涤沉淀并离心收集有机溶剂与上清液合并，所得溶液室温下旋转蒸发除去溶剂，剩余物用少量有机溶剂复溶，再将得到的样品基质以一种功能化复合材料，有效富集动物组织中的微量兽药残余，方便进行后续的检测步骤。本发明具有简便易操作，耗时短，成本低，设备低廉的优点，本发明可以适用于所有动物组织。
【IPC分类】G01N1/28
【公开号】CN105527136
【申请号】CN201410572392
【发明人】李嫣, 刘晓丹, 冯嘉楠, 邓春晖
【申请人】复旦大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2014年10月23日