一种对自由基反应的检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分析测试技术领域，具体涉及一种对自由基反应的检测方法。
【背景技术】
[0002]自由基反应广泛存在于多种化学及生物学过程中。因为经自由基聚合反应产生的聚合物缺乏信号报告功能，所以传统的对自由基反应的检测方法需要对反应产物进行标记或修饰来完成。这种标记或修饰过程往往需要较长的反应时间及较繁琐的操作过程，并且这类方法容易受样品中浊度和色度的干扰，不利于推广应用。
[0003]聚合物膜电位型传感技术结构简单、成本低廉，不受浊度和色度干扰，在很多领域具有不可替代的优势。虽然对聚离子敏感的聚合物膜电极已经被广泛应用于多种生物目标物的检测，但是将其用于人工合成聚离子检测的报道相对较少。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种自由基反应的检测方法及其应用。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]—种对自由基反应的检测方法，利用通过自由基反应聚合阳离子或阴离子单体，以对聚阳离子或聚阴离子敏感的聚合物膜电极为指示电极，进而对自由基反应与可引发自由基反应的物质的检测。
[0007]所述的阳离子单体为可发生自由基聚合反应并在酸度为中性条件下带正电荷的物质；
[0008]所述的阴离子单体为可发生自由基聚合反应并在酸度为中性条件下带负电荷的物质。
[0009]所述的阳离子单体为N-氨基丙基甲基丙烯酰胺、N-氨基乙基甲基丙烯酰胺、N-氨基丁基甲基丙烯酰胺、N-氨基乙基丙烯酰胺、N-氨基丙基丙烯酰胺、N-氨基丁基丙烯酰胺或丙烯酰胺；
[0010]所述的阴离子单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、甲基丁烯酸、丁烯酸或乙基丙烯酸。
[0011]所述的对聚阳离子敏感的聚合物膜电极为掺杂有阳离子交换剂的电极；阳离子交换剂为四(4-氟苯基)硼酸钠、四(4-氯苯基)硼酸钠、四(4-甲基苯基)硼酸钠、四(4-三氟甲基苯基)硼酸钠、四(3，5-二 (三氟甲基)苯基)硼酸钠或四苯基硼酸钠。
[0012]所述的对聚阴离子敏感的聚合物膜电极为掺杂有阴离子交换剂的电极；阴离子交换剂为二壬基萘磺酸、二壬基萘磺酸钠、二壬基二萘磺酸、二壬基二萘磺酸钠、三十二烷基一甲基氯化铵、四十二烷基氯化铵、三十二烷基一甲基溴化铵或四十二烷基溴化铵。
[0013]具体检测方法:
[0014](I)以对聚阳离子或聚阴离子敏感的聚合物膜电极为工作电极、饱和甘汞电极为参比电极进行电位检测；
[0015](2)在50mM HEPES(pH=7.4)溶液中添加与阳离子或阴离子单体，加入不同浓度的待测物引发自由反应；
[0016](3)将工作电极放入50mM HEPES(pH= 7.4)溶液中记录初始电位值，而后将步骤
(2)入不同浓度的待测物引发自由反应的产物加入50mM HEPES(pH = 7.4)溶液中记录不同待测物产生的聚离子电位的变化值；
[0017](4)以不同待测物产生的聚离子的电位信号为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线；
[0018](5)按照(1)-(4)的步骤对实际样品进行测试，根据标准工作曲线计算样品中待测物的浓度值。
[0019]本发明方法可用于多种可引发自由基反应的目标物检测，如辣根过氧化物酶、芬顿试剂、G-四联体核酸酶、过氧化氢酶、漆酶。
[0020]本发明所具有的优点:本发明利用自由基反应聚合阳离子或阴离子单体，以对聚阳离子或聚阴离子敏感的聚合物膜电极为指示电极，可实现对自由基反应与可引发自由基反应的物质的检测。该方法操作简单、灵敏度高，不需繁琐的标记和修饰步骤;该方法可用于多种可引发自由基反应的目标物如辣根过氧化物酶、芬顿试剂、G-四联体核酸酶、过氧化氢酶、漆酶等的检测。
【附图说明】
[0021]图1为本发明实施例1中检测辣根过氧化物酶的电位响应图(a)及其校正曲线(b)。
[0022]图2为本发明实施例2中检测Fe2+和Cu2+的校正曲线。
[0023]图3为本发明实施例3中检测过氧化氢酶的电位响应图(a)及其校正曲线(b)。
[0024]图4为本发明实施例4中检测G-四联体核酸酶的电位响应图(a)及其校正曲线(b)。
【具体实施方式】
[0025]以下具体实施例用来进一步说明本发明，但本发明绝非仅限于这些例子。
[0026]本发明利用自由基反应聚合阳离子或阴离子单体，以对聚阳离子或聚阴离子敏感的聚合物膜电极为指示电极，可实现对自由基反应与可引发自由基反应的物质的检测。
[0027]实施例1
[0028]以N-氨基丙基甲基丙烯酰胺为阳离子单体，以二壬基萘磺酸掺杂的聚合物膜电极为指示电极，实现了对辣根过氧化物酶的检测。其操作步骤如下:
[0029](I)聚合物膜电极的制备
[0030]称取196mg聚氯乙烯、196mg邻硝基苯辛醚、4.0mg 二壬基萘磺酸溶于3.0mL四氢呋喃中，搅拌均匀后倒入固定在玻璃板上的内径为3.5cm的玻璃环中。待四氢呋喃挥发完毕后，使用打孔器将膜切割为内径为3mm的小圆片并粘贴到底部套有PVC管的移液枪枪头上。使用的HEPES溶液作为内充液及活化液活化电极，待用。
[0031](2)自由基反应的引发
[0032]使用50mM HEPES缓冲溶液(pH = 7.4)中加入葡萄糖氧化酶(200nM)，葡萄糖(1mM)，N-氨基丙基甲基丙烯酰胺(0.5M)，乙酰丙酮(0.5mM)和不同浓度(5 X 10—'1X10'3X 10—6、5X 10—6、1 X 10—5U/mL)的辣根过氧化物酶，在室温下反应半小时。
[0033](3)电位信号的采集
[0034]将工作电极放入50mM HEPES(pH = 7.4)溶液中记录初始电位值，而后加入上述反应的产物，使上述反应的产物稀释3300倍，记录电位的变化值。
[0035](4)标准工作曲线的绘制
[0036]以不同待测物产生的聚离子的电位信号为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线，实验结果见图1。
[0037](5)按照(1)-(4)的步骤对实际样品进行测试，根据标准工作曲线计算样品中待测物的浓度值。
[0038]由图1可见使用该传感器可实现对辣根过氧化物酶的高灵敏检测，线性范围为IXI O—5 ?5 X I O—7U/mL，检出限为 2 X I O—7U/mL。
[0039]实施例2
[0040]本发明以N-氨基丙基甲基丙烯酰胺为阳离子单体，以二壬基萘磺酸掺杂的聚合物膜电极为指示电极，实现了芬顿试剂Fe2+和Cu2+的检测。其操作步骤如下:
[0041](I)聚合物膜电极的制备
[0042]称取196mg聚氯乙烯、196mg邻硝基苯辛醚、4.0mg 二壬基萘磺酸溶于3.0mL四氢呋喃中，搅拌均匀后倒入固定在玻璃板上的内径为3.5cm的玻璃环中。待四氢呋喃挥发完毕后，使用打孔器将膜切割为内径为3mm的小圆片并粘贴到底部套有PVC管的移液枪枪头上。使用的HEPES溶液作为内充液及活化液活化电极，待用。
[0043](2)自由基反应的引发
[0044]使用50mM HEPES缓冲溶液(pH = 7.4)中加入葡萄糖氧化酶(200nM)，葡萄糖(101^)，1氨基丙基甲基丙烯酰胺(0.510，乙酰丙酮(0.51^)和不同浓度的(0.5，1，2，5