一种测定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制剂活性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物传感技术领域，尤其涉及一种利用电化学方法测定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制剂活性的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白激酶催化蛋白磷酸化是一种非常重要的蛋白质翻译后修饰方式，能够调节细胞内大多数蛋白的功能。蛋白的磷酸化修饰与众多生理过程紧密相关，如信号传导、代谢调控、DNA损伤修复、基因转录和细胞凋亡等。蛋白激酶是一种磷酸转移酶，能够将三磷酸腺苷(ATP)上的γ -磷酸基团转移到底物蛋白特定的酪氨酸(Tyr)、苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)残基上。蛋白激酶是酶家族的重要成员，活性正常的蛋白激酶体系是细胞信号传导运作的核心，但当其活性异常或者过度表达时就会引起某些蛋白磷酸化的异常。人类许多疾病就和蛋白磷酸化异常密切相关，如癌症、糖尿病及老年痴呆等。由于蛋白激酶调控着每个组织、每个器官、甚至每个细胞的生死，从而已成为治疗这些复杂疾病的重要药物靶点。因此，测定蛋白激酶的活性及筛选蛋白激酶抑制剂在生物医学诊断以及酶靶药物开发等领域激起了人们的兴趣。
[0003]传统测定蛋白激酶的方法一般都是通过蛋白磷酸化的程度，采用放射性同位素标记法、表面等离子共振法、质谱法、荧光法和免疫法等来检测的，这些检测手段和方法在一定程度上促进了对蛋白激酶活性研究，然而各自又具有一定的局限性。放射性元素标记ATP技术，检测方法直接、灵敏度高，但存在放射性污染，不能进行组织标记;免疫法对磷酸化识别抗体的要求较高，专一性不强、费用高。因此，开发一种快速、简便、经济、灵敏度高且无需标记的蛋白激酶活性检测及高通量筛选抑制剂方法是非常必要的。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作简单、灵敏度高、检测范围宽、且检测用时短的利用电化学方法测定蛋白激酶活性的方法和蛋白激酶抑制剂活性的方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为:
[0006]—种测定蛋白激酶(PKA)活性的方法，包括以下步骤:
[0007](I)处理金电极:准备多根金电极并清理干净金电极表面，然后在金电极表面滴加氧化石墨烯溶液，烘干备用；
[0008](2)测定蛋白激酶的活性:选取一组不同浓度的蛋白激酶和同一浓度的ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)进行水浴反应，得到一组蛋白激酶反应液，再分别将得到的蛋白激酶反应液和Na2MoO4溶液滴加在步骤(I)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行方波伏安曲线测试，根据伏安曲线得到峰电流，将得到的峰电流与每根金电极对应的蛋白激酶的浓度做标准曲线；
[0009](3)根据所述标准曲线计算不同浓度下蛋白激酶的活性。
[0010]上述的方法，优选的，所述步骤⑵中，ATP浓度为50?500μΜ，ΑΤΡ浓度的选取需进行优化，其优化过程具体为:选取一组不同浓度的ATP分别和同一浓度的蛋白激酶进行水浴反应，得到一组蛋白激酶反应液，再分别将得到的一组蛋白激酶反应液和Na2MoO4溶液滴加在步骤(I)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行方波伏安曲线测试，根据伏安曲线分别得到峰电流，选取电信号增加最大时对应的ATP浓度即为最优的ATP浓度。更优选的，ΑΤΡ浓度为250μΜ。
[0011 ] 上述的方法，优选的，所述步骤⑵中，Na2MoO4溶液的浓度为6?1mM，水浴反应的温度35.5?38.5°C，水浴反应的时间为I?2小时，静置的时间为10?30min。
[0012]上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，方波伏安曲线测试的条件为:电解液为0.5M的H2SO4，电压为0.1?0.5V，频率为15HZ。
[0013]上述的方法，优选的，金电极的表面清理过程具体为:将金电极在含Al203的抛光布上进行抛光，抛光后的金电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗，用氮气吹干。
[0014]本发明还提供一种测定蛋白激酶抑制剂活性的方法，包括以下步骤:
[0015](I)处理金电极:准备多根金电极并清理干净金电极表面，然后在金电极表面滴加氧化石墨烯溶液，烘干备用；
[0016](2)测定蛋白激酶抑制剂的活性:选用一组不同浓度的蛋白激酶抑制剂分别和同一浓度的蛋白激酶、同一浓度的ATP进行水浴反应，再分别将得到的反应液与Na2MoO4溶液滴加在步骤(I)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行扫方波伏安曲线测试，根据伏安曲线分别得到峰电流，将得到的峰电流与每根金电极对应的蛋白激酶抑制剂的浓度做拟合曲线；
[0017](3)根据所述拟合曲线计算不同浓度下蛋白激酶抑制剂对蛋白激酶活性的抑制程度。
[0018]上述的方法，优选的，所述步骤⑵中，ATP浓度为50?500μΜ，ΑΤΡ浓度的选取需进行优化，其优化过程具体为:选取一组不同浓度的ATP分别和同一浓度的蛋白激酶进行水浴反应，得到一组蛋白激酶反应液，再分别将得到的一组蛋白激酶反应液和Na2MoO4溶液滴加在步骤(I)处理后的金电极表面，静置后烘干，然后分别对金电极进行方波伏安曲线测试，根据伏安曲线分别得到峰电流，选取电信号增加最大时对应的ATP浓度即为最优的ATP浓度。更优选的，ΑΤΡ浓度为250μΜ。
[0019]上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，Na2MoO4的浓度为Na2MoO4的浓度为6?1mM;水浴反应的温度35.5?38.5°C，水浴反应的时间为I?2小时，静置的时间为10?30min。
[0020]上述的方法，优选的，所述步骤(2)中，方波伏安曲线测试的条件为:电解液为0.5M的H2SO4，电压为0.1?0.5V，频率为15HZ。
[0021]上述的方法，优选的，所述步骤(I)中，金电极的表面清理过程具体为:将金电极在含Al 203的抛光布上进行抛光，抛光后的金电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗，用氮气吹干。
[0022]本发明的原理如图1所示，是基于蛋白激酶PKA可以催化水解三磷酸腺苷ATP生成二磷酸腺苷(ADP)和游离的磷酸根，且磷酸根在酸性条件下与钼酸钠反应生成能产生电信号的磷钼酸钠沉淀，电信号的大小与蛋白激酶活性成正相关，从而可以通过电化学法测定蛋白激酶PKA的活性及抑制性。
[0023]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0024](I)本发明的方法避开了现有技术中繁琐的蛋白磷酸化的步骤，直接通过电化学信号大小来测定PKA水解ATP产生的游离磷酸根的量，从而反映出蛋白激酶PKA的活性。该方法操作简单、灵敏度高、检测范围宽、且检测用时短，具体的表现为本发明可以在0.0005?500U/mL范围内测定蛋白激酶PKA的活性，跨越5个数量级，检测范围宽。本发明的灵敏度高，本发明的检测线可以达到2U/L(以信噪比为3的方法)，远远低于之前文献报道的基于半合成荧光法测定PKA活性(500U/L)、石墨烯量子点测定PKA活性(30U/L)和银纳米簇测定PKA活性(500U/L)等。本发明省去了常规繁琐的蛋白磷酸化过程，只是通过“混合-检测”就可以在I.5个小时完成整个步骤，用时短，操作方便;同时可推广到其他磷酸水解酶的活性测定。
[0025](2)本发的方法操作简单、灵敏度高，这为高效、快速、低投入地筛选多种有效的PKA抑制剂提供了新的思路。
【附图说明】
[0026]图1为本发明的原理不意图。
[0027]图2为本发明的实施例1中不同浓度的PKA电化学响应信号图。
[0028]图3为本发明的实施例1中浓度范围为5U/L?500U/mLPKA活性对应的标准曲线图。
[0029 ]图4为本发明实施例2中不同浓度的PKA抑制剂H_89的电化学响应信号图。
[0030]图5为本发明实施例2中不同浓度的PKA抑制剂对PKA活性抑制得曲线拟合图。
【具体实施方式】
[0031]为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
[0032]除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0033]除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
[0034]实施例1:
[0035]—种本发明的测定蛋白激酶活性的方法，包括以下步骤:
[0036](I)处理金电极:将多根直径为2mm的金电极在含有0.05μηι的AI2O3抛光布上进行抛光，抛光后的金电极用二次水冲洗，再用无水乙醇和二次水分别超声清洗5分钟，将附着于金电极表面的抛光粉清除干净，再用氮气吹干。将清洗好的金电极、Ag/AgCl参比电极和铂丝对电极共同放入装有5mmol.L—1的铁氰化钾溶液的反应池内，在-0.1-0.6V电压下，进行循环伏安法扫描，设定扫描速度为0.1V.s